發(fā)布時(shí)間：2018-04-19 09:04

  本文選題：南方水稻黑條矮縮病毒(SRBSDV) + 白背飛虱(Sogatella　； 參考：《中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院》2016年博士論文

【摘要】：南方水稻黑條矮縮病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)最早于2001年在中國(guó)廣東省陽(yáng)江市發(fā)現(xiàn)。SRBSDV是呼腸孤病毒科(Reoviridae)斐濟(jì)病毒屬(Fijivirus)的成員,其引起的南方水稻黑條矮縮病可導(dǎo)致水稻生產(chǎn)的嚴(yán)重減產(chǎn)。該病毒通過(guò)白背飛虱(WBPH,Sogatella furcifera Horvath,Hemiptera:Delphacidae)以持久增殖型方式進(jìn)行傳播。在過(guò)去的幾年內(nèi),借助白背飛虱的遷移,SRBSDV已經(jīng)迅速蔓延至中國(guó)南部、越南北部、日本和泰國(guó),成為亞洲東南部和東部最重要的水稻病毒病之一。白背飛虱可借助風(fēng)力進(jìn)行長(zhǎng)距離遷移,因此其在亞洲大部分國(guó)家均有分布,包括中國(guó)、巴基斯坦、日本、韓國(guó)、沙特阿拉伯、泰國(guó)、印度、印度尼西亞、斐濟(jì)、孟加拉國(guó)和塞舌爾。帶毒白背飛虱的遷移分散可導(dǎo)致SRBSDV的二次侵染,進(jìn)而造成南方水稻黑條矮縮病的爆發(fā)。病毒通過(guò)與介體昆蟲(chóng)之間的特異性互作來(lái)完成其有效的傳播,這種互作可以幫助病毒在昆蟲(chóng)體內(nèi)各個(gè)組織間運(yùn)輸,并能克服昆蟲(chóng)各種免疫反應(yīng)。目前針對(duì)病毒在介體內(nèi)侵染、移動(dòng)和復(fù)制過(guò)程的分子機(jī)理和涉及的互作蛋白的研究較少,因此,為解析介體昆蟲(chóng)的傳毒機(jī)制則必須明確和鑒定與病毒互作的介體昆蟲(chóng)蛋白。在本研究中,我們利用了酵母雙雜交技術(shù),以SRBSDV的外殼蛋白P10為誘餌,篩選了介體白背飛虱的cDNA文庫(kù),共獲得了130個(gè)互作的白背飛虱蛋白。根據(jù)基因注釋(GO)對(duì)這130種互作蛋白進(jìn)行了分類(lèi),其中依據(jù)分子功能可分為12類(lèi),依據(jù)生物學(xué)過(guò)程可分為9類(lèi),依據(jù)細(xì)胞組分可分為8類(lèi)。同時(shí)對(duì)這些互作蛋白的的最佳匹配物種進(jìn)行了分析,其中12.3%的蛋白與內(nèi)華達(dá)古白蟻(Zootermopsis nevadensis)同源,9.2%與赤擬谷盜(Tribolium castanetum)同源,4.6%可比對(duì)上白背飛虱已知序列,4.6%與致倦庫(kù)蚊(Culex quinquefasciatu)同源,3.5%分別與柑橘木虱(Diaphorina citri)、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)、歐洲熊蜂(Bombus terrestris)和苜蓿切葉蜂(Megachile rotundata)同源。根據(jù)互作蛋白的分子功能、參與的生物過(guò)程以及blast的比對(duì)結(jié)果,選出28種候選蛋白進(jìn)行了酵母雙雜交再次共轉(zhuǎn)驗(yàn)證,β-半乳糖苷酶實(shí)驗(yàn)顯示25種蛋白與SRBSDV-P10存在互作,其中15種蛋白存在顯著互作。隨后對(duì)這15種蛋白的編碼序列進(jìn)行擴(kuò)增,利用5’RACE試劑盒以酵母雙雜篩選到的序列為基礎(chǔ)獲得了5種蛋白的全長(zhǎng)ORF,分別為囊泡相關(guān)膜蛋白7(VAMP7)、囊泡運(yùn)輸?shù)鞍?Vtila)、生長(zhǎng)激素誘導(dǎo)的跨膜蛋白(Ghitm)、初生多肽相關(guān)復(fù)合體alpha亞基和ATP合成酶脂質(zhì)結(jié)合蛋白(線粒體)。進(jìn)一步利用pull-down技術(shù)對(duì)這5種蛋白與SRBSDVP10的互作進(jìn)行了驗(yàn)證,結(jié)果顯示其中3種蛋白(VAMP7、Vtila和Ghitm)與SRBSDV-P10存在互作。我們進(jìn)一步通過(guò)RT-qPCR對(duì)pull-down驗(yàn)證的互作蛋白VAMP7,Vti1a和Ghitm進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄水平分析。結(jié)果顯示VAMP7和Ghitm在雄性成蟲(chóng)中表達(dá)量高,Vti1a在雌性成蟲(chóng)階段含量豐富。比較分析VAMP7,Vti1a和Ghitm在白背飛虱6種不同組織(血淋巴、唾液腺、腸、馬氏管、脂肪體和卵巢)轉(zhuǎn)錄水平,結(jié)果顯示VAMP7主要在腸內(nèi)轉(zhuǎn)錄,Vti1a和Ghitm在馬氏管內(nèi)轉(zhuǎn)錄水平最高。在不同發(fā)育階段和不同組織轉(zhuǎn)錄水平的差異表明這些蛋白在不同階段和組織發(fā)揮不同的功能。研究結(jié)果表明白背飛虱的這3種蛋白質(zhì)與SRBSDV-P10存在互作,推測(cè)這些蛋白參與到病毒傳播和在昆蟲(chóng)不同組織、細(xì)胞和器官內(nèi)移動(dòng)的復(fù)雜過(guò)程中。
[Abstract]:In the past few years , we have used yeast two - hybrid technology , which can be divided into 12 classes by means of the specific interaction between the virus and the host insects . The results showed that the three proteins ( VAMP7 , Vtila and Ghitm ) had the highest level of transcription . The results showed that the three proteins ( VAMP7 , Vtila and Ghitm ) had the highest levels of transcription . The results showed that the three proteins ( VAMP7 , Vtila and Ghitm ) had the highest levels of transcription .

【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S435.11
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本文編號(hào)：1772454