發(fā)布時間：2018-04-13 09:40

  本文選題：鞘蕊蘇 + 茅蒼術　； 參考：《湖北中醫(yī)藥大學》2016年博士論文

【摘要】：本論文由兩部分組成,第一部分是鞘蕊蘇二萜類生物合成機制,第二部分是蒼術根莖、葉基因表達差異研究。第一部分:鞘蕊蘇藥材藥用植物名為毛喉鞘蕊花(Coleus forskohlii(Wild)Briq),系唇形科(Labiatae)鞘蕊花屬植物。野生毛喉鞘蕊花的發(fā)源地為印度次大陸,主要分布在印度、尼泊爾、緬甸、斯里蘭卡、泰國等亞熱帶國家,我國云南會澤、東川等地有少量發(fā)現(xiàn)植物學家界定為稀有物種。民間將該中草藥用于治療哮喘、咳嗽、腫瘤等疾患,療效顯著。鑒于鞘蕊蘇的獨特療效。湖北福人藥業(yè)公司將其開發(fā)為“鞘蕊蘇膠囊”中藥新藥,獲得生產(chǎn)批件【批件號:2011S00365】。為了解決鞘蕊蘇膠囊產(chǎn)業(yè)化所需原料藥材的供求問題,湖北中醫(yī)藥大學劉焱文教授科研團隊與湖北福人藥業(yè)公司產(chǎn)學研結合,從云南會澤縣移植鞘蕊蘇至湖北通城規(guī)范化種植。本論文對鞘蕊蘇5個二萜合成酶基因,即TPS1、TPS3、TPS4、TPS14和TPS15進行克隆,并且研究其其特異性表達,以期提鞘蕊蘇藥材二萜有效成分的含量,從而為通城種植鞘蕊蘇藥材培育優(yōu)良種質(zhì)提供了科學實驗的依據(jù)。1以鞘蕊蘇種子萌發(fā)2周左右的幼苗為試材,提取RNA并去除g DNA后反轉(zhuǎn)錄成c DNA,行成克隆模板。以二萜相關基因不同合成途徑CPS和KS的保守區(qū)域設計引物,通過引物特異性PCR克隆出保守區(qū)域堿基片段,再通過3’RACE和5’RACE分別進行3’和5’端編碼區(qū)全長的擴增,將測序結果進行拼接,利用拼接的引物設計基因全長擴增的引物,再次引物特異性PCR,最終得到基因的全長序列?2對Cf TPS14、Cf TPS15的CDS序列進行生物信息學分析。通過NCBI進行Blast X比對分析,Cf TPS14為映式貝殼杉烯合成酶,Cf TPS15為映式柯巴基焦磷酸合成酶。Cf TPS14等電點為5.38,分子式為C3987H6231N1073O1194S42,脂肪系數(shù)為91.35,主要平均疏水特性(GRAVY)為-0.189,表現(xiàn)為親水性,細胞定位其分布在細胞膜外?Cf TPS15等電點為6.86,分子式為C3633H5629N993O1046S27,脂肪系數(shù)為87.65,主要平均疏水特性(GRAVY)為-0.371,表現(xiàn)為親水性,細胞定位在細胞膜外?3針對測序得到的二萜相關基因保守區(qū)域堿基序列設計q PCR引物,設計原則為擴增長度:100-300 bp;引物長度:18±2;Tm值:54±1℃;引物自身沒有發(fā)卡結構,引物之間不易形成二聚體結構。分析結果表明,Cf TPS1為柯巴基焦磷酸異構體合成酶,Cf TPS3、Cf TPS4為丹參酮二烯和13R淚柏醚合成酶,Cf TPS14為映式貝殼杉烯合成酶,Cf TPS15為映式柯巴基焦磷酸合成酶。Cf TPS1和Cf TPS3參與鐵銹醇前體丹參酮的合成,故Cf TPS1和Cf TPS3主要在根和根莖中表達,莖中含量較少;Cf TPS3和Cf TPS4參與佛斯柯林前體13R淚柏醚的合成,因此Cf TPS3主要在根和根莖中表達,Cf TPS4可能參與其他催化過程,因此在花和葉中含量較高;Cf TPS14和Cf TPS15參與次霉素前體映式貝殼杉烯的合成,因此在花和葉中含量較高,在根中含量較低。上述研究表明,q PCR分析結果與基因特異性表達趨勢基本一致。4以CfTPS15基因的CDS設計引物,并加入SalⅠ和NotI酶切位點,采用PCR技術擴增得到帶有酶切位點的基因CDS序列,通過酶切位點將Cf TPS15與表載體Pet28a連接,并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌細胞BL21,再通過加入適當?shù)恼T導劑IPTG誘導Cf TPS15基因的蛋白表達?第二部分:茅蒼術Atractylodes lancea(Thunb.)DC.(Compositae菊科),是我國傳統(tǒng)常用藥材。茅蒼術的根莖具有燥濕健脾、祛風散寒、明目等功效。主要有效成分為蒼術素、β-桉葉醇、蒼術醇和蒼術酮等萜類化合物。由于市場對茅蒼術的需求與日俱增,茅蒼術野生資源受到掠奪性采挖,導致數(shù)量銳減。因此,人工種植已成為必由之路。而如何提高茅蒼術根莖產(chǎn)量、保證藥材質(zhì)量是人工種植要解決的首要問題。盡管茅蒼術的化學成分、藥理學、生理生化、栽培技術等研究較多,根莖形成和生長的分子機制仍不清楚,很大一部分原因是缺乏茅蒼術基因組信息。近年來發(fā)展的高通量轉(zhuǎn)錄組技術為茅蒼術功能基因組研究提供了有效手段。1以江蘇茅山的茅蒼術為研究對象,對其根莖和葉的轉(zhuǎn)錄組進行測序。構建了茅蒼術總RNA的c DN文庫,采用Illumina Hi Seq2000平臺對茅蒼術的轉(zhuǎn)錄組進行了測序和從頭組裝。通過移除adaptor序列和低質(zhì)量的讀序后,分別從葉和根莖轉(zhuǎn)錄組得到118,397,448和152,688,850clean reads;總核苷酸數(shù)達33,885,787,250 bp(20 G),平均讀序長度均為125 bp;在所有的茅蒼術樣品中共計有22,891條unigene表達,其中5,693條、4,502條、6,430條、3,504條和9,296條unigene分別在2份葉樣品和3份根莖樣品中表達�？偣灿�39,664條序列(占所有unigene總數(shù)的42.90%)與nr數(shù)據(jù)庫中已知的基因相匹配,這些數(shù)列中的26,159(28.32%)條unigene被歸類到一個或多個GO項下。將unigene映射到KEGG數(shù)據(jù)庫的參考代謝通路,總計10,504條unigene被注釋,可歸入289條KEGG代謝途徑;161個Unigenes功能被注解為CYP450s,屬于71 CYP家族類;92366個Unigenes中確定了10103個SSR,其中1074個Unigenes包含兩個以上的微衛(wèi)星D NA,而且406個SSR存在于復合形式。2茅蒼術葉和根莖轉(zhuǎn)錄組的特異性表達分析。在葉和根莖中轉(zhuǎn)錄豐度高的(FPKM1000)的基因分別有227條和105條,其中有47條在兩種組織中共存。GO富集分析中,4,982DEGs映射到GO數(shù)據(jù)庫中,共有262個GO項目明顯富集。KEGG富集分析表明,1,158條上調(diào)的unigene與159條KEGG途徑相關聯(lián),其中29條unigene歸于植物激素信號傳導(ko04075),而多數(shù)unigene與淀粉和糖代謝(ko00500)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工(ko04141)和氨基酸的生物合成(ko01230)相關。將茅蒼術的測序結果與AGRIS數(shù)據(jù)庫中比對,鑒別出42個轉(zhuǎn)錄因子家族;葉中共有60個轉(zhuǎn)錄子上調(diào),根莖中共有67個轉(zhuǎn)錄子上調(diào)。3選擇20個差異性表達基因(DEGs)的q PCR驗證RNA測序和計算結果表明,所有選擇的基因q PCR相對表達量和轉(zhuǎn)錄組分析具有相同的趨勢。測試了這些基因的關系,發(fā)現(xiàn)它們之間有顯著的正相關關系,相關系數(shù)達到0.81。4通過DEGs進一步分析參與根莖起始和發(fā)育的候選基因,鑒定了104個基因共同參與器官發(fā)育、激素生物合成和激素信號轉(zhuǎn)導,其中包括一些轉(zhuǎn)錄因子(2個MADS盒蛋白,12個類AP2轉(zhuǎn)錄因子)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：湖北中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S567.239

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 彭國忠;茅蒼術野生變家種初報[J];中藥材科技;1983年06期

2 徐友貴;蘇筱娟;黃馳;;茅蒼術病害的防治研究[J];中藥材;1990年07期

3 賀善安,賀慧生,呂曄,岡田稔,武田修已,三木榮二;茅蒼術資源的保護和利用[J];植物資源與環(huán)境;1993年01期

4 萬永紅;茅山特產(chǎn)——茅蒼術[J];植物雜志;2001年06期

5 宋艷嬌;吳沿友;朱詠莉;施倩倩;;不同類型茅蒼術組培過程中蔗糖含量的無菌動態(tài)檢測[J];江蘇農(nóng)業(yè)科學;2011年01期

6 李秋萍;黃達芳;;鎮(zhèn)江茅蒼術資源概況[J];黑龍江醫(yī)藥;2012年06期

7 黃馳;徐友貴;;茅蒼術野生轉(zhuǎn)家種研究通過技術鑒定[J];中藥材;1990年11期

8 徐友貴;王小明;田中聯(lián);魏大為;;茅蒼術根結線蟲病的調(diào)查與防治研究[J];中藥材;1991年10期

9 徐友貴,田中聯(lián),王小明,黃馳;茅蒼術生物學特性研究初報[J];中國中藥雜志;1992年01期

10 宋剛;沈菲;王慶濤;楊士虎;謝正林;;茅蒼術無菌培養(yǎng)體系的構建[J];江蘇農(nóng)業(yè)科學;2013年11期

相關會議論文 前10條

1 徐曉蘭;王鳴;夏冰;馮煦;郭可躍;;不同產(chǎn)地茅蒼術的質(zhì)量比較[A];藥用植物研究與中藥現(xiàn)代化——第四屆全國藥用植物學與植物藥學術研討會論文集[C];2004年

2 谷巍;吳啟南;;道地茅蒼術揮發(fā)性成分氣質(zhì)聯(lián)用分析[A];全國第8屆天然藥物資源學術研討會論文集[C];2008年

3 黃俊斌;李建洪;王沫;詹亞華;汪文杰;;茅蒼術主要病害的發(fā)生特點及其綜合防治技術初控[A];全國第六屆天然藥物資源學術研討會論文集[C];2004年

4 居學鋒;詹亞華;;羅田縣野生茅蒼術垂直分布調(diào)查[A];全國第六屆天然藥物資源學術研討會論文集[C];2004年

5 詹亞華;居學鋒;;湖北羅田縣茅蒼術栽培歷史、物候期及花性別比例調(diào)查[A];全國第六屆天然藥物資源學術研討會論文集[C];2004年

6 巢建國;劉海萍;陶燕;;茅蒼術快速繁殖研究[A];2006海峽兩岸暨CSNR全國第七屆天然藥物資源學術研討會論文集[C];2006年

7 朱東海;付梅紅;方婧;宋紅月;熊玉蘭;;茅蒼術野生品與栽培品主要藥效學差異比較研究[A];2009年全國中藥學術研討會論文集[C];2009年

8 歐陽臻;張磊;王慶慶;楊小麗;趙明;;茅蒼術水提物不同極性部位HPLC指紋圖譜研究及綜合聚類分析[A];全國第9屆天然藥物資源學術研討會論文集[C];2010年

9 巢建國;谷巍;孔令婕;;不同產(chǎn)地茅蒼術HPLC指紋圖譜研究[A];全國第9屆天然藥物資源學術研討會論文集[C];2010年

10 郭蘭萍;黃璐琦;;茅蒼術Atractylodes lancea(Thunb.)DC. 的遺傳變異及其與揮發(fā)油成分變異的相關性[A];全國中藥研究學術討論會論文集[C];2003年

相關重要報紙文章 前1條

1 ;省微生物學會:把茅山藥做成品牌[N];江蘇科技報;2008年

相關博士學位論文 前2條

1 黃茜茜;鞘蕊蘇二萜類生物合成機制與茅蒼術根莖、葉基因表達差異研究[D];湖北中醫(yī)藥大學;2016年

2 王鶴翔;茅蒼術化學成分、碘催化偶聯(lián)反應及生物堿Spirotryprostatin B的全合成研究[D];蘭州大學;2010年

相關碩士學位論文 前10條

1 劉菊燕;茅蒼術的血清藥物化學和血清藥理學研究[D];南京中醫(yī)藥大學;2015年

2 鐘慧;中藥植物茅蒼術抗菌活性及活性物質(zhì)研究[D];廣西師范大學;2015年

3 楊騰;茅蒼術內(nèi)生真菌與其植物圈微生物的互作及對宿主抗旱的影響[D];南京師范大學;2013年

4 呂立新;不同化學型茅蒼術內(nèi)生真菌多樣性及對宿主揮發(fā)油影響的比較研究[D];南京師范大學;2013年

5 梁雪飛;內(nèi)生放線菌與叢枝菌根真菌對茅蒼術組培苗生長及揮發(fā)油積累的影響研究[D];南京師范大學;2013年

6 許夢云;道地藥材茅蒼術的遺傳多樣性分析[D];江蘇大學;2009年

7 汪六英;茅蒼術及術類藥材資源化學研究及其抗骨質(zhì)疏松癥生物活性的初步評價[D];江蘇大學;2007年

8 陳佳;茅蒼術生態(tài)環(huán)境、藥材品質(zhì)及其最佳采收期的研究[D];湖北中醫(yī)藥大學;2013年

9 宋慧潔;湖北大別山區(qū)茅蒼術的主要生物學特性及生理特征初探[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2013年

10 侯芳潔;茅蒼術的種質(zhì)資源調(diào)查及品質(zhì)評價[D];南京中醫(yī)藥大學;2008年

，

本文編號：1743943