發(fā)布時間：2018-04-11 12:14

  本文選題：豬瘟病毒 + 感染性克隆��； 參考：《浙江大學》2015年博士論文

【摘要】：豬瘟是豬的重要傳染病,具有致死性及高度傳染性等特點,其病原為豬瘟病毒(Classical Swine Fever Virus, CSFV),為黃病毒科瘟病毒屬成員,是有囊膜的單股正鏈RNA病毒。CSFV基因組長約12.3kb,基因組兩端為非編碼區(qū),編碼區(qū)為一個11697bp的開放性閱讀框,編碼長度為3898個氨基酸的多聚前體蛋白,在宿主細胞蛋白酶的作用下逐步裂解為8種非結構蛋白和4種結構蛋白,基因組內的順序依次為Npro、Core、Erns、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、 NS5A和NS5B,其中Core、Erns、E1和E2為結構蛋白。對CSFV主要蛋白的功能研究已較為深入,在病毒復制及其與宿主細胞互作研究方面也取得了進展,這些研究成果得益于感染性克隆技術發(fā)展。以疫苗C株作為骨架進行新型豬瘟標記疫苗的開發(fā)是一大研究熱點,但相對于強毒株,C株病毒本身在體外培養(yǎng)細胞中的生長較慢。我們發(fā)現(xiàn)以C株感染性克隆為基礎拯救的重組病毒滴度較低,可能與其細胞適應性差有關。本研究擬在C株和強毒株石門株感染性克隆的基礎上,通過對兩個毒株不同蛋白區(qū)段進行相互置換,構建一系列重組嵌合病毒,以研究結構蛋白及非結構蛋白對豬瘟病毒細胞適應性的影響,解析影響豬瘟病毒在ST細胞和PK-15細胞中復制的重要蛋白,為從基因水平上對疫苗C株進行改造提供依據(jù),也為進一步探索豬瘟病毒體外復制和組裝機制奠定基礎。1.重組c株商低代次毒株與石門株體外增殖能力差異比較在相同感染比條件下,無論是高代次還是低代次重組C株病毒(RecCpp40和RecCpp80)在細胞內的增殖能力均弱于石門株,但三株病毒感染過程中基因組復制水平差異不明顯(P0.05)。感染后96h RecCpp80的子代病毒數(shù)量是RecCpp40的30倍以上(P0.01)；感染后96h細胞外病毒粒子數(shù)比較結果顯示,胞內病毒增殖能力與釋放到胞外的病毒量成正比,石門株胞內增殖能力強,釋放到胞外的病毒粒子數(shù)也顯著高于重組C株病毒(P0.05);石門毒株C株細胞間的擴散能力顯著優(yōu)于RecCpp80,特別是在覆蓋瓊脂糖的情況下,石門毒株的擴散能力受瓊脂培養(yǎng)基的影響較小,在兩種培養(yǎng)條件下均能形成大而彌散的病毒斑。因此,我們推測C株與石門株之間的細胞適應性差異主要與病毒在細胞內的增殖能力及其細胞間擴散能力相關。2.豬瘟病毒C株與石門株嵌合病毒構建及其細胞內增殖能力和兔體反應比較為了解析不同毒株體外增殖能力差異的分子基礎,我們構建了石門株的感染性克隆,并以疫苗C株和石門株感染性克隆為基礎構建了豬瘟病毒結構蛋白和非結構蛋白編碼基因互換的感染性克隆,并成功拯救了石門株重組病毒和11個重組嵌合豬瘟病毒。體外生長特性比較結果顯示,疫苗C株和石門株半長基因組的相互置換可提高C株病毒的體外增殖能力,其中置換有石門株非結構蛋白至非編碼區(qū)半長的嵌合毒株與C株重組病毒RecCpp80相似。置換石門毒株NS2-NS4B的重組嵌合C株病毒體外增殖能力顯著提高,而置換有C株NS2-NS4B區(qū)段嵌合石門毒株的體外增殖能力低于親本石門重組病毒,說明非結構蛋白NS2-NS4B區(qū)段對豬瘟病毒的體外增殖具有重要作用。置換石門毒株NS4A-3 -UTR片段或NS5A-3 -UTR,不增強C株嵌合病毒的體外增殖能力。為了評價基因置換對疫苗C株兔體適應性的影響,將嵌合毒株進行了兔體接種實驗。結果顯示,分別含有C株前半長(結構蛋白)或后半長(非結構蛋白)基因的嵌合毒株均能夠引起兔定型熱反應,含有石門毒株NS2-NS4B基因區(qū)段的嵌合C株病毒亦能引起兔體溫升高反應,但置換C株NS4A-3-UTR和NS2-NS4B區(qū)段的嵌合石門毒株則不誘導兔體發(fā)熱反應。以上結果說明C株的兩端非編碼區(qū)以及結構蛋白區(qū)域與兔體適應性密切相關。3.豬瘟病毒NS2跨膜區(qū)在病毒增殖中的作用為了初步解析NS2蛋白在豬瘟病毒增殖中的作用,對NS2的N端6個跨膜結構(Transmembrane, TM)序列分別進行了PCR擴增后,構建了12個含有NS2不同區(qū)段融合表達GFP的真核表達重組質粒,轉染ST細胞后比較了不同跨膜區(qū)融合蛋白的亞細胞定位。結果表明,NS2蛋白N端不同區(qū)段的跨膜結構均能在定位于內質網中,在細胞內呈現(xiàn)網狀分布。以石門株感染性克隆為模板,對NS2的N端6段潛在跨膜結構進行單段缺失,或通過在跨膜區(qū)核心序列中央插入丙氨酸改變跨膜區(qū)構象,成功構建12個NS2不同突變的感染性克隆,體外轉錄RNA電轉ST細胞以拯救重組病毒。結果顯示,缺失任何一段NS2跨膜結構均導致病毒復制缺陷,不能產生子代病毒。在TMl正中插入丙氨酸后不影響子代病毒復制和組裝,在TM3和TM6中相應的插入則導致病毒產生時間延后,在3-4代連續(xù)傳代才能獲得重組病毒；而在TM2,4,5中分別插入突變后,病毒RNA在細胞內呈低水平復制,且不產生重組病毒。上述結果說明NS2的跨膜區(qū)在豬瘟病毒復制和組裝過程中具有重要作用,但作用的具體機制需要進一步研究。綜上所述,我們以豬瘟病毒C株與石門株之間在體外培養(yǎng)細胞適應性差異為切入點,通過結構蛋白和非結構蛋白基因置換以及NS2蛋白跨膜區(qū)的缺失或丙氨酸插入,探明了非結構蛋白NS2-NS4B區(qū)以及NS2跨膜區(qū)對豬瘟病毒的增殖具有重要作用,疫苗C株基因組兩端的非編碼區(qū)以及結構蛋白區(qū)域介導兔體發(fā)熱反應。研究結果為深入探索豬瘟病毒的增殖機制和豬瘟疫苗C株的改良奠定了良好基礎。
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【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S855.3

【參考文獻】

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