發(fā)布時(shí)間：2025-01-04 06:43

　　目的:構(gòu)建H37Ra Hsp16.3基因敲除菌株以及回補(bǔ)菌株,研究Hsp16.3在H37Ra菌株中的功能,并觀察該基因敲除菌株對(duì)小鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞炎性細(xì)胞因子表達(dá),趨化功能以及抗原呈遞功能的影響。方法:1.通過(guò)同源重組技術(shù)構(gòu)建Hsp X基因敲除菌株（MUT）;向MUT菌株電轉(zhuǎn)化p MV261-Hsp X質(zhì)粒構(gòu)建Hsp X基因敲除回補(bǔ)菌株（COMP）。2.通過(guò)對(duì)比野生型菌株（WT）、COMP和MUT菌株的菌落特征和生長(zhǎng)速率來(lái)觀察Hsp16.3的缺失對(duì)H37Ra菌株的影響。3.構(gòu)建體外WT、COMP和MUT菌株感染巨噬細(xì)胞的潛伏感染模型。在該模型構(gòu)建成功后繼續(xù)培養(yǎng)24h和48h,Real-time PCR檢測(cè)巨噬細(xì)胞炎性細(xì)胞因子i NOS、IL-6和TNF-α基因表達(dá)水平,Western-blot檢測(cè)i NOS的蛋白表達(dá)水平,ELISA檢測(cè)IL-6和TNF-α蛋白表達(dá)水平。4.通過(guò)transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Hsp16.3對(duì)巨噬細(xì)胞趨化功能的影響,Real-time PCR檢測(cè)趨化因子CCL2、CCL3、CCL4、CCL5和CCL12基因表達(dá)水平,FCM檢測(cè)F4/80+CCR1+、F4/80...

【文章頁(yè)數(shù)】：88 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
中英文縮略詞表
中文摘要
英文摘要
前言
第一部分
    1 材料與方法
        1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料和試劑
            1.1.1 質(zhì)粒與菌株
            1.1.2 引物
            1.1.3 培養(yǎng)基及緩沖液配置
            1.1.4 試劑耗材
            1.1.5 儀器耗材
        1.2 實(shí)驗(yàn)方法
            1.2.1 培養(yǎng)方法及保存
            1.2.2 p0004s-AES質(zhì)粒構(gòu)建
            1.2.3 phAE159-AES質(zhì)粒構(gòu)建
            1.2.4 制備噬菌體
            1.2.5 噬菌體裂解液轉(zhuǎn)染待敲除菌株
            1.2.6 制備結(jié)核分枝桿菌電轉(zhuǎn)化態(tài)
            1.2.7 電擊轉(zhuǎn)化結(jié)核分支桿菌感受態(tài)細(xì)胞
            1.2.8 HspX基因缺失菌株以及回補(bǔ)菌株的鑒定
                1.2.8.1 菌株蛋白制備
                1.2.8.2 Western-blot檢測(cè)菌株Hsp16.3 的表達(dá)
                    1.2.8.2.1 試劑配置
                    1.2.8.2.2 實(shí)驗(yàn)步驟
            1.2.9 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定
            1.2.10 菌落形態(tài)觀察
        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
    2 結(jié)果
        2.1 HspX基因敲除菌株的構(gòu)建
            2.1.1 基因敲除相關(guān)引物設(shè)計(jì)序列定位
            2.1.2 PCR擴(kuò)增左右臂
            2.1.3 噬菌粒的構(gòu)建
            2.1.4 構(gòu)建分枝桿菌噬菌體
            2.1.5 結(jié)核分枝桿菌H37Ra HspX基因敲除菌株(MUT)的構(gòu)建
        2.2 PCR驗(yàn)證結(jié)核分枝桿菌H37Ra HspX基因敲除菌株
        2.3 結(jié)核分枝桿菌H37Ra HspX基因回補(bǔ)菌株(COMP)的構(gòu)建
        2.4 菌株Hsp16.3表達(dá)的檢測(cè)
        2.5 菌株生長(zhǎng)曲線測(cè)定
        2.6 MUT菌株菌落形態(tài)
    3 討論
第二部分
    1 材料與方法
        1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料和試劑
            1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
            1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
            1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器
        1.2 方法
            1.2.1 小鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)及培養(yǎng)
            1.2.2 CD4⁺T細(xì)胞提取及刺激
            1.2.3 制作巨噬細(xì)胞細(xì)胞爬片
            1.2.4 吞噬率檢測(cè)
            1.2.5 體外潛伏感染模型的構(gòu)建
            1.2.6 熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞因子基因表達(dá)水平
                1.2.6.1 總RNA的提取
                1.2.6.2 RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA
                1.2.6.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)列表
                1.2.6.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系及其條件
            1.2.7 ELISA檢測(cè)巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的細(xì)胞因子
                1.2.7.1 樣品及試劑準(zhǔn)備
                1.2.7.2 檢測(cè)
            1.2.8 Western-blot檢測(cè)巨噬細(xì)胞蛋白表達(dá)
            1.2.9 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞相關(guān)分子表達(dá)水平
            1.2.10 transwell實(shí)驗(yàn)
        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    2 結(jié)果
        2.1 BMDM的誘導(dǎo)成熟
        2.2 小鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞對(duì) MUT 菌株的吞噬率檢測(cè)
        2.3 小鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞在不同MOI下受感染情況
        2.4 MUT菌株對(duì)小鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞炎性細(xì)胞因子m RNA表達(dá)的影響
        2.5 MUT菌株對(duì)小鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響
        2.6 MUT菌株對(duì)小鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞趨化功能的影響
        2.7 MUT菌株對(duì)小鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞抗原提呈功能的影響
            2.7.1 MUT菌株對(duì)小鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞吞噬體-溶酶體的影響
            2.7.2 MUT菌株對(duì)小鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞MHCⅡ表達(dá)的影響
            2.7.3 MUT菌株對(duì)小鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞CIITA及其轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的影響
            2.7.4 MUT菌株對(duì)小鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)體系中IFN-γ和IL-10 表達(dá)的影響
            2.7.5 MUT菌株對(duì)小鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞p-STAT1/p-STAT3表達(dá)的影響
        2.8 MUT菌株對(duì)小鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞胞內(nèi)殺傷功能的影響
    3 討論
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡(jiǎn)介



本文編號(hào)：4023058