發(fā)布時間：2020-11-22 01:58

　　 自體動靜脈內(nèi)瘺(native Arteriovenous Fistulae,AVF)是終末期腎病患者進行血液透析的常用建瘺方式,但常因血管內(nèi)膜增生造成的管腔狹窄而導(dǎo)致失功。血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能異常是造成新生內(nèi)膜增生的重要原因。防止血管內(nèi)膜增生及術(shù)后再狹窄一直是亟待解決的重要課題。整聯(lián)蛋白β3(Integrinβ3)是一種存在于多種細(xì)胞表面的黏附分子,可介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo),參與調(diào)控細(xì)胞的自噬、增殖、遷移等生理過程。我們前期的工作已經(jīng)發(fā)現(xiàn)整聯(lián)蛋白β3可通過影響內(nèi)皮間質(zhì)化促進新生內(nèi)膜增生。自噬是細(xì)胞維持穩(wěn)態(tài)的一種自我更新機制,在血管損傷修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用,但內(nèi)皮細(xì)胞自噬異常會誘導(dǎo)內(nèi)膜增生。然而目前整聯(lián)蛋白β3是否通過影響內(nèi)皮細(xì)胞自噬而參與內(nèi)膜增生并不清楚。為了研究整聯(lián)蛋白β3對自噬的影響及其調(diào)控機制,我們收集了臨床AVF標(biāo)本,評估其內(nèi)膜增生與內(nèi)皮細(xì)胞自噬之間的關(guān)系;然后利用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC),通過誘導(dǎo)HUVEC高表達整聯(lián)蛋白β3并構(gòu)建整聯(lián)蛋白β3敲低細(xì)胞,在細(xì)胞水平實驗研究整聯(lián)蛋白β3對內(nèi)皮細(xì)胞自噬的影響,并進一步對參與調(diào)控自噬的相關(guān)信號分子進行了檢測;最后,我們還研究了二甲雙胍對內(nèi)皮細(xì)胞自噬的作用及其調(diào)節(jié)機制。結(jié)果如下:1.內(nèi)膜嚴(yán)重增生的AVF中內(nèi)皮細(xì)胞自噬相關(guān)分子呈高表達。HE染色結(jié)果顯示,靠近瘺口部位靜脈內(nèi)膜明顯增厚;免疫熒光檢測結(jié)果顯示,增厚的血管內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞LC3高表達。2.整聯(lián)蛋白β3促進內(nèi)皮細(xì)胞自噬。Realtime-PCR和Western Blot結(jié)果顯示,TGFβ1誘導(dǎo)整聯(lián)蛋白β3表達,細(xì)胞自噬標(biāo)志分子LC3Ⅱ和Beclin-1表達也升高;整聯(lián)蛋白β3敲低后,LC3Ⅱ和Beclin-1的mRNA和蛋白水平均明顯下降。3.整聯(lián)蛋白β3通過YAP信號調(diào)節(jié)自噬。Western Blot結(jié)果顯示,整聯(lián)蛋白β3表達增加或敲低情況下,Notch信號轉(zhuǎn)錄因子NICD、AKT、pAKT、pJNK表達變化不明顯;整聯(lián)蛋白β3敲低可下調(diào)細(xì)胞中Hippo信號通路中YAP(Yes-Associated Protein)YAP及其下游轉(zhuǎn)錄因子CTGF、LC3Ⅱ表達水平,表明整聯(lián)蛋白β3可能通過抑制YAP信號阻止內(nèi)皮細(xì)胞自噬;4.二甲雙胍通過抑制YAP表達,促進YAP失活降低內(nèi)皮細(xì)胞自噬水平。CCK-8結(jié)果表明,10、20、40mmol/L二甲雙胍處理24h均可降低細(xì)胞存活率;電鏡、免疫熒光及Western Blot結(jié)果表明,二甲雙胍可阻止細(xì)胞中自噬體形成,降低LC3II、Belin-1、CTGF表達,促進YAP磷酸化水平。我們的研究表明整聯(lián)蛋白β3可能通過促進Hippo通路中的YAP引起內(nèi)皮細(xì)胞自噬,敲低或抑制整聯(lián)蛋白β3的表達能夠抑制細(xì)胞自噬,可能對內(nèi)皮細(xì)胞起到保護作用,但還需要在動物模型上進一步驗證。本研究加深了我們對調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬分子機制的理解,也為臨床上防控血管內(nèi)膜增生提供了新的靶點及實驗參考。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：R692.5
【部分圖文】：

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文153結(jié)果3.1AVF術(shù)后靜脈端血管內(nèi)膜增生HE染色的血管標(biāo)本切片置于切片數(shù)字掃描儀下掃描，可見與相對遠(yuǎn)離瘺口的部位相比，相對靠近瘺口的部位靜脈內(nèi)膜增厚更明顯，管腔受堵嚴(yán)重（圖1AB）。圖1HE染色觀察人AVF術(shù)后靜脈端血管內(nèi)膜增生情況（20×）Figure1.ObservationofintimalhyperplasiainhumanveinafterAVFbyHEstaining(20×)（A.靠近瘺口處靜脈；B.遠(yuǎn)離瘺口處靜脈）3.2AVF術(shù)后內(nèi)皮細(xì)胞中LC3的檢測免疫熒光檢測的結(jié)果顯示，位于增厚的血管內(nèi)膜最內(nèi)側(cè)的內(nèi)皮層中，LC3的表達較強；在增生的內(nèi)膜中，觀察到SMAα的廣泛表達（圖2）。圖2免疫熒光染色觀察人AVF術(shù)后靜脈端LC3的表達情況（上200×，下400×）Figure2.ImmunofluorescencestainingwasusedtoobservetheexpressionofLC3inhumanveinafterAVF(upper200×,lower400×)

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文153結(jié)果3.1AVF術(shù)后靜脈端血管內(nèi)膜增生HE染色的血管標(biāo)本切片置于切片數(shù)字掃描儀下掃描，可見與相對遠(yuǎn)離瘺口的部位相比，相對靠近瘺口的部位靜脈內(nèi)膜增厚更明顯，管腔受堵嚴(yán)重（圖1AB）。圖1HE染色觀察人AVF術(shù)后靜脈端血管內(nèi)膜增生情況（20×）Figure1.ObservationofintimalhyperplasiainhumanveinafterAVFbyHEstaining(20×)（A.靠近瘺口處靜脈；B.遠(yuǎn)離瘺口處靜脈）3.2AVF術(shù)后內(nèi)皮細(xì)胞中LC3的檢測免疫熒光檢測的結(jié)果顯示，位于增厚的血管內(nèi)膜最內(nèi)側(cè)的內(nèi)皮層中，LC3的表達較強；在增生的內(nèi)膜中，觀察到SMAα的廣泛表達（圖2）。圖2免疫熒光染色觀察人AVF術(shù)后靜脈端LC3的表達情況（上200×，下400×）Figure2.ImmunofluorescencestainingwasusedtoobservetheexpressionofLC3inhumanveinafterAVF(upper200×,lower400×)

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文22細(xì)胞，利用WesternBlot方法檢測siRNA處理后整聯(lián)蛋白β3的表達情況，結(jié)果顯示，第三種siRNA的敲低效果最好（圖3，P<0.001），故后續(xù)實驗中均使用此敲低細(xì)胞（Integrinβ3KD）。圖3整聯(lián)蛋白β3敲低細(xì)胞的鑒定Figure3.IdentificationofIntegrinβ3knockdownHUVECcellsA．WesternBlot檢測siRNA處理后Integrinβ3的表達情況B.WesternBlot條帶量化分析（a：與Scr組比較，P<0.001）3.2整聯(lián)蛋白β3對自噬相關(guān)分子mRNA表達水平的影響Realtime-PCR的結(jié)果顯示，經(jīng)TGFβ1處理后，HUVEC中整聯(lián)蛋白β3、Beclin-1和LC3的mRNA表達明顯升高（P<0.05，圖4）；而在Integrinβ3敲低的HUVEC中，上述三個分子的mRNA水平則顯著下調(diào)（P<0.05，圖4）。圖4Integrinβ3敲低對自噬相關(guān)分子mRNA表達水平的影響Figure4．EffectofIntegrinβ3knockdownonmRNAexpressionofautophagy-relatedmoleculesA．Integrinβ3mRNA的相對表達量B．Beclin-1mRNA的相對表達量C．LC3mRNA的相對表達量（a：與ctl組比較，P<0.05；b：與TGF組比較，P<0.05）
【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 Yang Yuan;Xiangnan Zhang;Yanrong Zheng;Zhong Chen;;Regulation of mitophagy in ischemic brain injury[J];Neuroscience Bulletin;2015年04期

2 王寧;段維勛;楊陽;李悅;梁振興;金振曉;易定華;俞世強;;γ-分泌酶抑制劑對姜黃素后處理心肌保護作用的影響[J];山東醫(yī)藥;2013年06期

本文編號：2893929