發(fā)布時(shí)間：2020-11-18 20:30

　　 在真核生物細(xì)胞中MADS-box基因通過與其它轉(zhuǎn)錄因子互作調(diào)控多種生物過程。在酵母,植物,昆蟲,線蟲,哺乳動物和低等的脊椎動物中都有MADS-box蛋白的存在。目前,植物的數(shù)據(jù)庫中有上百種MADS-box結(jié)構(gòu)域的蛋白。這些蛋白都具有保守的DNA結(jié)合和二聚體化結(jié)構(gòu)域(MADS-box結(jié)構(gòu)域)。目前MADS-box五個家族成員已被發(fā)現(xiàn),酵母中的Mcm1和Arg80,擬南芥中的Agamous,人類中的Deficiens和SRF。赤霉基因組中含有兩類MADS-box轉(zhuǎn)錄因子,其中之一與酵母的MCM1同源,屬于SRF類的MADS-box轉(zhuǎn)錄因子(I型),在酵母中MCM1的敲除突變體是致死的;另外一個與酵母當(dāng)中的Rl M1同源,屬于MEF2類的MADS-box轉(zhuǎn)錄因子(II型)。Mcm1蛋白在各種生物過程中都發(fā)揮著重要的作用,包括微小染色體維持蛋白,新陳代謝,細(xì)胞識別和信息素應(yīng)答。本研究鑒定了禾谷鐮刀菌中MADS-box蛋白Fg Mcm1的功能。Fgmcm1突變體的分生孢子產(chǎn)量與野生型相比大約降低了2000倍,突變體不能夠產(chǎn)生產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)?瓶梗,孢子直接在菌絲頂端產(chǎn)生。Fgmcm1突變體在分生孢子的形態(tài)上也有缺陷,77.2±5.6%的分生孢子有1-3個細(xì)胞。19.9±1.7%的分生孢子頂端有一個細(xì)胞是斷裂的,通過(DAPI/Calcoflour)染色發(fā)現(xiàn)斷裂的分生孢子與頂端是相連的。野生型的分生孢子每個細(xì)胞含有單個細(xì)胞核,而突變體的分生孢子每個細(xì)胞里有多個細(xì)胞核。這些觀察結(jié)果表明Fg MCM1調(diào)控瓶梗和分生孢子的發(fā)育。有性階段,Fgmcm1敲除突變體不產(chǎn)子囊殼,這說明Fg MCM1在調(diào)節(jié)有性生殖過程中發(fā)揮著重要的作用。Fgmcm1突變體對氧化還原和膜脅迫都降低了敏感性。通過揚(yáng)花盛期的小麥穗、玉米稈侵染實(shí)驗(yàn)證明,Fgmcm1突變體無論在致病性和DON的產(chǎn)量上都嚴(yán)重降低。通過隨機(jī)插入帶有MCM1自身啟動子的MCM1-GFP融合片段到Fgmcm1突變體中,獲得MCM1基因互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子�；パa(bǔ)轉(zhuǎn)化子分生孢子形態(tài)、產(chǎn)量,DON產(chǎn)量和致病性等方面都恢復(fù)到野生型狀態(tài)。亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)表明,Fg MCM1-GFP信號無論在孢子還是菌絲中都定位在細(xì)胞核。大約50%的Fgmcm1突變體的菌落形態(tài)是不穩(wěn)定的,能夠產(chǎn)生菌落形態(tài)特別小的菌株MD(例如MD1,MD2),在各種固體培養(yǎng)基中,包括CM,MM和5×YEG都存在類似現(xiàn)象。MD的菌絲寬度是不規(guī)則,菌落能夠長出類似于扇形的角變菌落,將這些突出的扇形角變菌落重新接種,其生長速度能夠恢復(fù)到Fgmcm1突變體的狀態(tài)。在異宗配合的輪枝鐮孢菌敲除Fvmcm1突變體,并沒有發(fā)現(xiàn)菌落形態(tài)不穩(wěn)定的現(xiàn)象。與野生型比較,類似于Fgmcm1突變體,Fvmcm1突變體的產(chǎn)孢率(包括大孢子和小孢子),真菌毒素FB1的產(chǎn)量,均出現(xiàn)顯著下降。Fvmcm1突變體的瓶梗也是缺陷的,要比野生型細(xì)而長。在萌發(fā)條件下,小孢子能夠直接萌發(fā)產(chǎn)生小孢子,這可能是由于Fv MCM1的敲除導(dǎo)致細(xì)胞之間的識別缺陷所引起的。酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)表明Fg Mcm1既與Mat1-1-1互作也和Fst12互作,而這兩個轉(zhuǎn)錄因子對有性生殖都是至關(guān)重要的。Fgmcm1 mat1-1-1雙突變體的菌落形態(tài)是穩(wěn)定的,生長速度與Fgmcm1突變體相同,而Fgmcm1 fst12雙突變體的菌落形態(tài)是不穩(wěn)定的,大約有42.6﹪的Fgmcm1 fst12雙突變體能夠產(chǎn)生菌落形態(tài)生長發(fā)育不良的表型。這就說明Fgmcm1突變體菌落形態(tài)不穩(wěn)定的現(xiàn)象可能是由于Fg MCM1的敲除導(dǎo)致與配體位點(diǎn)的基因互作發(fā)生變化而引起的。RNA-seq分析表明,相對于突變體Fgmcm1菌株,在生長缺陷菌株MD1中,一定數(shù)量的與有性生殖相關(guān)的基因在MD1里是上調(diào)表達(dá)的,這就進(jìn)一步說明為什么MD1的生長速度是受限制的。與野生型相比較,與致病性、次生代謝和產(chǎn)孢相關(guān)的基因在突變體Fgmcm1是下調(diào)表達(dá)的。綜上所述,在禾谷鐮刀菌中,Fg Mcm1在調(diào)控瓶梗、分生孢子的形成,有性生殖,致病性,次生代謝和細(xì)胞識別過程中都發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。
【學(xué)位單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：S432.44
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
英文縮寫表
第一章 前言
    1.1 禾谷鐮刀菌簡介
    1.2 輪枝鐮孢菌簡介
    1.3 MADS-box功能介紹
    1.4 MADS-box蛋白的特征
    1.5 酵母菌的MADS-box蛋白簡介
        1.5.1 酵母菌的SRF型MADS-box蛋白
        1.5.2 酵母菌的MEF型MADS-box蛋白功能介紹
    1.6 黑粉菌的MADS-box蛋白功能介紹
    1.7 稻瘟菌的MADS-box蛋白功能介紹
        1.7.1 稻瘟菌的Mig1（MEF型）對致病性的影響
        1.7.2 稻瘟菌的Mcm1（SRF型）對致病性的影響
    1.8 大孢糞殼菌的MADS-box蛋白功能介紹
    1.9 曲霉菌的MADS-box蛋白功能介紹
    1.10 禾谷鐮刀菌的MADS-box蛋白
第二章FGMCM1 基因結(jié)構(gòu)及敲除突變體的分析
    2.1 材料、試劑與儀器
        2.1.1 材料
        2.1.2 試劑
        2.1.3 儀器
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 Split PCR方法構(gòu)建MCM1 敲除突變體
        2.2.2 野生型禾谷鐮刀菌原生質(zhì)體的制備和轉(zhuǎn)化
        2.2.3 Fgmcm1 突變體的篩選和鑒定
        2.2.4 PH-1 及突變體基因組DNA的提取—CTAB法
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 FgMCM1 基因及蛋白序列分析
        2.3.2 Fgmcm1 基因敲除突變體的構(gòu)建
        2.3.3 PCR檢測所得到的轉(zhuǎn)化子
        2.3.4 Southern blot驗(yàn)證
    2.4 討論
第三章MCM1 在真菌發(fā)育過程中的調(diào)控作用
    3.1 材料、試劑和儀器
        3.1.1 材料
        3.1.2 試劑
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 菌落形態(tài)，菌落邊緣及生長速度測定
        3.2.2 Fgmcm1 突變體的孢子形態(tài)，產(chǎn)孢率及萌發(fā)實(shí)驗(yàn)
        3.2.3 有性生殖實(shí)驗(yàn)
        3.2.4 壓力篩選實(shí)驗(yàn)
        3.2.5 小麥穗與玉米桿接種實(shí)驗(yàn)
        3.2.6 Mcm1 蛋白的表達(dá)亞細(xì)胞定位及功能恢復(fù)驗(yàn)證
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 突變體的表型觀察
        3.3.2 對無性生殖的影響
        3.3.3 突變體Fgmcm1 對壓力篩選的缺陷
        3.3.4 突變體Fgmcm1 致病性下降
        3.3.5 亞細(xì)胞定位及其蛋白表達(dá)
        3.3.6 MCM1 基因?qū)τ行陨�殖的影�?br>    3.4 討論
第四章MCM1 對真菌細(xì)胞識別調(diào)控的作用
    4.1 材料、試劑和儀器
        4.1.1 材料
        4.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        4.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器
        4.1.4 培養(yǎng)基
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 RNA提取，純化及反轉(zhuǎn)錄
        4.2.2 酵母雙雜的方法驗(yàn)證與FgMCM1 互作基因
        4.2.3 突變體M1M，M2M的獲得
        4.2.4 輪枝鐮孢菌中所涉及到的實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.5 RNA-seqence測序及實(shí)時(shí)定量PCR
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 突變體Fgmcm1 營養(yǎng)生長不穩(wěn)定
        4.3.2 突變體MD的生長隨機(jī)恢復(fù)
        4.3.3 在異宗配合的Fvmcm1 突變體對生長發(fā)育的影響
        4.3.4 酵母雙雜驗(yàn)證蛋白的互作
        4.3.5 突變體M1M、M2M的構(gòu)建
        4.3.6 Fgmcm1 與PH-1 比較基因表達(dá)的差異
        4.3.7 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)與RNA-seq分析
        4.3.8 表達(dá)量變化的基因的功能驗(yàn)證
    4.4 討論與展望
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
作者簡介

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本文編號：2889171