對細胞粘附和遷移的遠程、時空和可逆控制對于許多生物技術(shù)應用和細胞療法是非常重要的實現(xiàn)手段。在本文中,我們展示了在修飾有插入Arg-Gly-Asp(RGD)配體的光響應蛋白LOV2的表面上實現(xiàn)光調(diào)控細胞的粘附和遷移。藍光照射引起LOV2的結(jié)構(gòu)變化,并暴露RGD序列,導致蛋白質(zhì)粘附和遷移增強。把表面放回黑暗的環(huán)境會導致配體重新“籠住”,細胞分離。黏附和遷移可在多個循環(huán)中可逆調(diào)節(jié)。通過精確控制光的位置,可以實現(xiàn)細胞的定向遷移。利用光控蛋白結(jié)構(gòu)控制配體的顯示實現(xiàn)細胞黏附和遷移的可逆和時空控制,對于準確定義和調(diào)節(jié)細胞材料在體外和體內(nèi)的相互作用具有很大的前景。第一章介紹了文章的背景知識,所用到的材料和實驗方法。首先我們對光響應蛋白及其應用進行了簡單介紹,又介紹了課題中所用到的LOV2蛋白,我們提到了它的來源及其在光調(diào)控下的性質(zhì)。隨后我們介紹了細胞黏附和遷移的基本情況,它的生物學意義和分子基礎,我們重點提及了整合素和RGD序列在細胞黏附中的作用。第二章詳細介紹了對LOV2突變蛋白的設計和實驗方法,對其性質(zhì)進行了初步的測試。我們在LOV2蛋白的J α螺旋上選擇了兩個RGD序列的插入位點,它們對LOV2蛋白的結(jié)構(gòu)影響最小。另外,設計了在LOV2蛋白C端連上RGD序列作為陽性對照和把前述三種RGD換成RGE作為陰性對照。所設計的六種突變蛋白具有和原始LOV2蛋白相同的光調(diào)控性質(zhì),它們在光照和黑暗狀態(tài)下的顏色變化可用肉眼直接觀察到,我們又測量了它們的UV,熒光和CD光譜。在第三章中,我們設計了以酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)為基礎的結(jié)合性ELISA實驗和競爭性ELISA實驗來驗證LOV2蛋白的光控解折疊功能,以及解開折疊后的暴露的RGD序列是否能夠被整合素蛋白相結(jié)合,以實現(xiàn)預想的蛋白功能。結(jié)果顯示突變蛋白與整合素結(jié)合符合我們的預期,在光照下結(jié)合得很好而在黑暗下則結(jié)合很弱。第四章我們介紹了通過把細胞在修飾有LOV2突變蛋白的培養(yǎng)基表面上培養(yǎng),可以實現(xiàn)光調(diào)控細胞的黏附和遷移。由于藍光照射可致LOV2突變蛋白的Jα螺旋展開,使得其中的RGD序列暴露出來,因而能使整合素與之結(jié)合,從而細胞可以黏附上去;在黑暗狀態(tài)下,突變蛋白發(fā)生結(jié)構(gòu)變化,展開的部分重新折疊成Jα螺旋,RGD序列被隱藏起來,細胞也與突變蛋白分離。利用這個性質(zhì),我們用一個移動的光纖照射表面實現(xiàn)了調(diào)控細胞的運動,細胞會朝著光照射的位點移動。我們也觀察了細胞在黏附過程中所發(fā)生的形態(tài)變化及其分離時的可恢復性。最后,我們對以上工作進行了總結(jié),并提出進一步深入研究的展望。
【學位單位】：南京大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：Q25
【部分圖文】：

其亞細胞定位、穩(wěn)定性甚至與特定目標的相互作用進行光控制。（２）蛋白質(zhì)活性的空和變構(gòu)調(diào)控。如果光能控制初級結(jié)構(gòu)，那么對折疊蛋白質(zhì)的直接光控制呢？最近的兩旨在利用獨特的策略來解決這一長期存在的挑戰(zhàn)。一種是基于“蛤殼”蛋白的概念，其活性區(qū)域兩側(cè)蛋白質(zhì)的兩端能相互結(jié)合，在空間上阻止該區(qū)域與下游目標相關聯(lián)。在調(diào)節(jié)這類Ｎ端和Ｃ端序列之間的聯(lián)系被證明足以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活性［１８］。為了使這種設基于光的控制，林和他的同事設計了熒光蛋白Ｄｒｏｎｐａ的變體，其與同種二聚體可以在分離。通過將丨）ｒｏ叩ａ的拷貝融合到不同靶蛋白的Ｎ和Ｃ端，他們實現(xiàn)了對多種鳥嘌呤交換因子、病毒蛋白酶和一系列哺乳動物激酶的光控制。Ｈａｈｎ等意識到前面描述的Ｌ０的Ｎ和Ｃ端在黑暗中相距約１０Ａ％并且該距離因ｊｏｔ螺旋的光誘導展開而增大［１９］。在創(chuàng)性研究中，作者使用結(jié)構(gòu)分析來確定Ｌ０Ｖ２插入蛋白的位置，使其兩端運動與蛋白質(zhì)性位點相耦合，用這種方法他們能夠設計成若干激酶、Ｒｈｏ家族ＧＴＰａｓｅ和ＧＥＦｓ的光開關。類似的方法現(xiàn)己擴展到其他蛋白質(zhì)，包括凋亡蛋白酶ｃａｓｐａｓｅ－３［２０］。??（ａ）?ｌｉｈｔ－ｓｗｉｔｃｈａｂｌｅ?ｌｉｎｅａｒ?ｍｏｔｉｆ?ｃｌａｍｓｈｅｌｌ?ｃｏｎｔｒｏｌ?ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ?ｃｏｎｔｒｏｌ??

０＝６、??ＨＯ?ＯＨ??圖１．４?ＦＭＮ分子結(jié)構(gòu)??１．２．２?ＬＯＶ２蛋白空間結(jié)構(gòu)與光調(diào)控下的結(jié)構(gòu)變化??從敁仞的發(fā)現(xiàn)汗始，ＬＯＶ蛋白就相繼在細菌、藻類、真菌和植物中被發(fā)現(xiàn)。ＬＯＶ蛋「Ｉ山??于在中間位置結(jié)合ｆ?？個黃素單核ｆｆ酸所以能夠起到藍光感受器的作用。在大腸桿菌中表達??和純化的蛋白是黃色的且在藍光激發(fā)下呈現(xiàn)綠色的熒）ＦＭＮ在信號傳導狀態(tài)下（藍光照射??Ｋ?）通過相鄰的半胱氨酸殘堪與蛋「Ｉ核心共價連接［５７］。??７??

在熒光顯微鏡下可以觀察到，當ＬＯＶ蛋白暴露在光下后，會經(jīng)歷一整個光循環(huán)。，ＬＯＶ蛋白會通過一個非共價相互作用結(jié)合ＦＭＮ基團，這個形態(tài)的蛋白在４４７ｎ的吸收峰［５８，５９］。當被藍光照射后，ＦＭＮ生色團與ＬＯＶ２中相鄰的半胱氨酸殘。這隨后介導激酶的激活，該激酶通過促進向光素自磷酸化在生物體內(nèi)誘導信己發(fā)現(xiàn)ＬＯＶ２結(jié)構(gòu)域的光化學反應性對激酶的激活至關重要，但蛋白質(zhì)ＬＯＶ１內(nèi)的功能仍不清楚。??ｒ?ｒ??Ｘａ＾Ｊｈ?＾??＼?Ｃｙｓ??Ｃｙｓ??圖１．６藍光照射下的，ＦＭＮ?＿向光素的半胱氨酸殘基形成共價化合物??
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本文編號：2894180