發(fā)布時(shí)間：2020-11-21 06:05

　　 鹽和干旱是范圍最大,影響最廣的非生物逆境脅迫,也是全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的兩大主要限制因素。鹽和干旱脅迫都會(huì)引起細(xì)胞失水,破壞細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡,致使細(xì)胞內(nèi)生理生化代謝紊亂,嚴(yán)重影響植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育。為了在日益嚴(yán)重的惡劣環(huán)境中生存和繁殖,陸地植物進(jìn)化出復(fù)雜的調(diào)控系統(tǒng)來響應(yīng)脅迫信號(hào)以提高植物的適應(yīng)能力。在鹽和干旱脅迫下,很多抗逆相關(guān)基因被大量誘導(dǎo)表達(dá),而這些基因的表達(dá)除了受脫落酸(ABA)信號(hào)途徑調(diào)控以外,還可以通過ABA非依賴性途徑調(diào)控,其中脫水應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(DREB)就在這個(gè)過程中發(fā)揮重要作用。然而,關(guān)于這類轉(zhuǎn)錄因子的研究大多還是集中在抗逆能力有限的作物及模式植物中,而在適應(yīng)能力超強(qiáng)的荒漠鹽生植物中的相關(guān)研究較少。四翅濱藜(Atriplex canescens)長(zhǎng)期生活在貧瘠的鹽堿荒漠地區(qū),具有超強(qiáng)的適應(yīng)能力,進(jìn)化出了獨(dú)特的抗逆機(jī)制。前期關(guān)于四翅濱藜抗逆機(jī)理的研究主要集中在生態(tài)恢復(fù)、種子萌發(fā)、生理適應(yīng)和離子轉(zhuǎn)運(yùn)等方面,對(duì)其轉(zhuǎn)錄因子在抗逆過程中的功能研究還未見詳細(xì)報(bào)道。因此,本研究克隆了四翅濱藜脫水響應(yīng)元件結(jié)合蛋白編碼基因AcDREB2,對(duì)其響應(yīng)鹽和滲透脅迫的表達(dá)模式進(jìn)行了分析,同時(shí)驗(yàn)證其轉(zhuǎn)錄激活活性,并將其在擬南芥中超表達(dá),以期進(jìn)一步明晰AcDREB2在植物耐鹽抗旱過程中的功能。主要取得以下研究結(jié)果:(1)AcDREB2基因全長(zhǎng)cDNA為867 bp,其中CDS序列729 bp,共編碼242個(gè)氨基酸,其N端含有1個(gè)該類基因特有的AP2/EREBP保守結(jié)構(gòu)域,其中第14位氨基酸殘基是保守的纈氨酸。氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),AcDREB2與已報(bào)道的其它同科植物和抗逆性強(qiáng)的荒漠植物的同源性較高。(2)在NaCl或滲透脅迫處理下,AcDREB2在四翅濱藜葉中表達(dá)量均顯著高于根和莖組織,且在處理3 h時(shí)表達(dá)量急速上升,表明AcDREB2的表達(dá)受鹽和滲透脅迫處理的快速誘導(dǎo)。(3)AcDREB2定位于細(xì)胞核,具有轉(zhuǎn)錄激活活性,能順利結(jié)合DRE順式元件,激活其下游報(bào)告基因的表達(dá)。推測(cè)AcDREB2在植物響應(yīng)逆境過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。(4)AcDREB2超表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽和抗旱能力。200 mM NaCl處理15天后,野生型植株矮化,葉片發(fā)黃萎蔫,而AcDREB2超表達(dá)植株的長(zhǎng)勢(shì)良好。通過比較分析生物量、葉綠素含量、光合參數(shù)、相對(duì)含水量、質(zhì)膜透性、離體葉片失水速率等各項(xiàng)指標(biāo),發(fā)現(xiàn)超表達(dá)植株均優(yōu)于野生型。同樣地,在周期性干旱處理14天后,AcDREB2超表達(dá)植株的生物量、葉綠素含量、凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、水分利用效率、相對(duì)含水量均顯著高于野生型,離體葉片失水速率也較野生型明顯降低。綜上所述,AcDREB2能對(duì)外界鹽和滲透脅迫環(huán)境做出快速響應(yīng),其超表達(dá)能夠通過調(diào)控植物對(duì)水分的吸收,維持體內(nèi)水分平衡,提高光合效率,從而緩解鹽及干旱脅迫對(duì)植物的損傷,顯著提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽抗旱能力。說明該轉(zhuǎn)錄因子在四翅濱藜抗逆性中發(fā)揮著重要作用。
【學(xué)位單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q943.2
【部分圖文】：

蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 四翅濱藜 AcDREB2 轉(zhuǎn)錄因子的克隆及功能分析進(jìn)行 Real-time PCR 反應(yīng)。3.1.7 轉(zhuǎn)錄活性分析3.1.7.1 酵母表達(dá)載體構(gòu)建本實(shí)驗(yàn)所用酵母載體有兩個(gè)，分別是 pGADT7 AD 和 pGBKT7 (圖 3-1)，酵母菌株為 Y2Hgold 和 Y187。載體和菌株均由蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供。通過 In-Fusion無縫克隆技術(shù)構(gòu)建酵母表達(dá)載體。

圖 3-2 pCAMBIA1302 的載體圖譜Fig. 3-2 Vector map of pCAMBIA1302植物表達(dá)載體構(gòu)建cDREB2 基因的植物表達(dá)載體是在上述亞細(xì)胞定位載體的基礎(chǔ)上，把 3 RD29A 誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，根據(jù) pCAMBIA1302 和 RD29A 序列設(shè)計(jì) In-Fu P19 和 P20(表 3-3)，載體構(gòu)建過程同 3.1.7.1。構(gòu)建成功的植物表達(dá)載29A-pCAMBIA1302-Bar-AcDREB2。同樣使用凍融法將植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)3101。 AcDREB2 轉(zhuǎn)基因擬南芥獲得及鑒定盛花期使用農(nóng)桿菌花序侵染法(Bechtold 和 Bouchez，1995)將 AcDREB中，同時(shí)以轉(zhuǎn)化pCAMBIA1302空載體的植株作為對(duì)照，使用BASTA (0所獲得的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株篩選至 T3代以獲得純合抗性植株。通過半定測(cè)轉(zhuǎn)基因擬南芥中 AcDREB2 的表達(dá)量，AcDREB2 鑒定引物為 P21 和

AcDREB2功能域分析
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本文編號(hào)：2892646