發(fā)布時(shí)間：2020-11-10 12:28

　　 本試驗(yàn)采用質(zhì)子化誘導(dǎo)處理黑蕓豆(Phaseolus vulgaris L.)凝集素,將凝集素置于低于等電點(diǎn)(pI)的系列低pH環(huán)境中,對(duì)其進(jìn)行質(zhì)子化誘導(dǎo),研究了凝集素結(jié)構(gòu)變化與致敏性消減的構(gòu)效關(guān)系,并進(jìn)一步探究了質(zhì)子化誘導(dǎo)處理后,溶液體系回調(diào)中性,對(duì)蕓豆分離蛋白品質(zhì)的影響。1、同源模建出蕓豆凝集素的三維結(jié)構(gòu),采用多種生物信息學(xué)工具預(yù)測(cè)出B和T細(xì)胞抗原表位,進(jìn)一步通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、淋巴細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子釋放試驗(yàn),對(duì)抗原表位進(jìn)行體外驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)4個(gè)B細(xì)胞抗原表位(B1:NVNDNGEPTLSS、B2:VGSEPKDKGG、B3:NNYKYDSNAHT和B4:LYNVHWDPKPRH)和2個(gè)T細(xì)胞表位(T1:LQRDATVSS和T2:FNIDVPNNS),高疏水性正電荷性質(zhì)的氨基酸殘基在凝集素抗原表位構(gòu)成中發(fā)揮重要作用。2、對(duì)蕓豆凝集素進(jìn)行質(zhì)子化誘導(dǎo)處理,研究發(fā)現(xiàn),凝集素結(jié)構(gòu)在不同質(zhì)子化條件,呈現(xiàn)逐漸展開(kāi)的過(guò)程,并在8 h達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)�；�于內(nèi)/外源熒光光譜、SDS-PAGE、動(dòng)態(tài)光散射(DLS)、分子排阻色譜(SEC)和差示掃描量熱法(DSC)分析發(fā)現(xiàn),質(zhì)子化誘導(dǎo)可引起凝集素結(jié)構(gòu)去折疊,甚至解聚,可能會(huì)掩埋、破壞或分裂凝集素表面抗原表位,并導(dǎo)致更多的凝集素胰蛋白酶酶切位點(diǎn)暴露。3、質(zhì)子化誘導(dǎo)處理的蕓豆凝集素與弗氏完全佐劑(CFA)混合乳化,連續(xù)腹腔注射致敏BALB/c小鼠5周,末次通過(guò)灌胃大劑量激發(fā)致敏。相對(duì)于Native組,經(jīng)處理后的凝集素致敏的BALB/c小鼠致敏癥狀減輕、免疫球蛋白(IgE和IgG_1)、mMCPT-1、組胺和細(xì)胞因子(IL-4、IL-5、IL-13及IFN-γ)含量均顯著降低。圓二色譜(CD)、傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)和分子動(dòng)學(xué)(MD)模擬表明,質(zhì)子化誘導(dǎo)可使凝集素α-螺旋含量顯著降低,β-折疊含量升高,凝集素蛋白結(jié)構(gòu)去折疊,更多的胰蛋白酶酶切位點(diǎn)暴露于蛋白表面。4、黑蕓豆分離蛋白經(jīng)質(zhì)子化誘導(dǎo)處理8 h后,回調(diào)pH至中性(即質(zhì)子化誘導(dǎo)還原處理),經(jīng)冷凍干燥,得到蕓豆蛋白粉。結(jié)構(gòu)分析表明,經(jīng)處理后的分離蛋白α-螺旋含量降低,β-折疊升高,分離蛋白結(jié)構(gòu)解折疊,更多的疏水性氨基酸暴露,總-SH和游離-SH含量顯著減少,二硫鍵(-S-S-)含量增加。功能性研究發(fā)現(xiàn),處理后的分離蛋白,具有更高的乳化性(EAI)和乳化穩(wěn)定性(ESI)、起泡性(FC)和起泡穩(wěn)定性(FS)、持油性(FHC)及凝膠性,而溶解性和持水性(WHC)降低。處理后的蕓豆蛋白粉凝血活性和致敏性顯著性降低,體外消化率明顯改善。
【學(xué)位單位】：合肥工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：TS201.21
【部分圖文】：

已確定結(jié)構(gòu)的外源凝集素?cái)?shù)量急劇增加。特別地是，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)及分子生物學(xué)的發(fā)展進(jìn)步，人們對(duì)植物凝集素的研究層次不僅只停留在其簡(jiǎn)單的生物活性水平上的了解，而是將其延伸到凝集素蛋白分子空間結(jié)構(gòu)水平上。迄今，已通過(guò)質(zhì)譜、核磁、X 射線(xiàn)晶體衍射、表面等離子共振和計(jì)算機(jī)模擬等技術(shù)手段確定了幾十種植物凝集素的結(jié)構(gòu)[2, 5, 6]，顯著推動(dòng)了凝集素領(lǐng)域的研究進(jìn)展，并為蛋白質(zhì)—碳水化合物相互作用及特異性結(jié)合專(zhuān)一性的研究提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[7]。豆科植物凝集素，是種類(lèi)最豐富，也是研究最徹底的凝集素家族，其幾乎均是從植物種子中分離出來(lái)。目前，豆科植物凝集素 PHA-E、PHA-L、ConA、大豆凝集素（SBA）、豌豆凝集素（PSA）和花生凝集素（PNA）等在內(nèi)的多種凝集素結(jié)構(gòu)已通過(guò)核磁及晶體學(xué)方法被測(cè)定，蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)中已有超過(guò) 200 種豆科植物凝集素結(jié)構(gòu)[5, 8]。從已獲得的植物凝集素晶體結(jié)構(gòu)表明：植物凝集素的一級(jí)、二級(jí)及空間結(jié)構(gòu)均較相似。這些凝集素多由2個(gè)或4個(gè)相同或幾乎相同的25~3kDa 的亞基組成，其中，每個(gè)亞基含有一個(gè)糖結(jié)合位點(diǎn)和兩個(gè)金屬離子（鈣和錳離子）結(jié)合位點(diǎn)，為金屬離子結(jié)合的糖蛋白，具有獨(dú)立特異性結(jié)合糖的能力[2, 9, 10]紅蕓豆凝集素（PHA-E）的晶體結(jié)構(gòu)如圖 1.1 所示。

[21]。圖1.2 植物凝集素機(jī)體中消化降解的可能機(jī)制（摘自Kumar 等[20]）Fig. 1.2 Possible mechanism of digestive degradation in lectins (Kumar et. al.[20])凝集素過(guò)敏反應(yīng)，主要由免疫球蛋白 IgE 介導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)，同時(shí)也存在非 IgE 介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，例如：IgE 和 IgG 共同介導(dǎo)的過(guò)敏反應(yīng)或免疫復(fù)合物介導(dǎo)的免疫反應(yīng)[20]。圖 1.2 為植物凝集素過(guò)敏反應(yīng)機(jī)制途徑，其致敏機(jī)制可分為兩個(gè)階段：凝集素過(guò)敏原初次接觸和凝集素過(guò)敏原二次接觸階段。機(jī)體初次接觸凝集素過(guò)敏原后，過(guò)敏原以 MHC II-抗原肽復(fù)合物的形式，由抗原呈遞細(xì)胞（主要是樹(shù)突細(xì)胞）處理和呈遞。然后，抗原表位肽被特異性 T 細(xì)胞受體（TCR）上的初始 CD4+T 細(xì)胞所識(shí)別

23]。圖1.3 植物凝集素過(guò)敏原誘發(fā)過(guò)敏反應(yīng)的機(jī)制途徑（摘自Kumar 等[20]）Fig 1.3 Possible mechanism of allergenicity induced by lectin allergens (Kumar et. al.[20])綜上所述，致敏反應(yīng)是機(jī)體對(duì)外來(lái)過(guò)敏原的直接免疫反應(yīng)，且主要由 IgE 抗體介導(dǎo)。近幾十年來(lái)，過(guò)敏性疾病的發(fā)病率逐漸增加，進(jìn)一步闡明致敏反應(yīng)的發(fā)病機(jī)制及過(guò)敏反應(yīng)的分子基礎(chǔ)具有重要意義。1.2.2 抗原表位抗原表位，又稱(chēng)抗原決定簇，是指抗原蛋白分子表面具有特殊結(jié)構(gòu)和免疫活性的區(qū)域。目前普遍認(rèn)為，在機(jī)體的免疫反應(yīng)過(guò)程中，免疫細(xì)胞通常難以借助其表面受體識(shí)別整個(gè)過(guò)敏原蛋白質(zhì)分子，而僅能識(shí)別抗原蛋白質(zhì)分子上的一段氨基酸序列，也就是說(shuō)抗體的特異性是針對(duì)抗原表位，而不是針對(duì)完整的抗原分子[24]。過(guò)敏原蛋白的免疫原性，主要由其抗原表位決定，即由抗體識(shí)別的蛋白質(zhì)部分，按與抗原受體結(jié)合細(xì)胞的不同
【參考文獻(xiàn)】

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3 劉紅;康玉凡;;pH對(duì)大豆7S、11S球蛋白功能特性影響[J];糧食與油脂;2013年08期

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本文編號(hào)：2877928