發(fā)布時間：2020-11-23 09:15

　　 細葉百合(Lilium pumilum)是一種分布范圍極廣的百合屬多年生草本植物,其適應(yīng)能力強,觀賞價值高,具有較強的抗逆性,是百合抗性育種的重要親本。NAC家族是植物最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一,受多種生物和非生物脅迫誘導(dǎo),不少研究已經(jīng)證實NAC轉(zhuǎn)錄因子參與了植物發(fā)育、生長調(diào)節(jié)以及逆境應(yīng)答等各個方面。本研究以實驗室前期獲得的細葉百合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)作為依據(jù),篩選出候選基因,以細葉百合鱗莖為材料克隆得到LpNAC6和LpNAC20基因,對其進行生物信息學(xué)和基因表達模式分析;利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草,獲得轉(zhuǎn)基因煙草株系;通過轉(zhuǎn)基因煙草鑒定LpNAC6和LpNAC20的過表達是否響應(yīng)鹽脅迫,從而為細葉百合NAC基因的進一步應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。具體研究結(jié)果如下:1.采用同源克隆技術(shù)成功克隆細葉百合LpNAC6和LpNAC20基因,其中LpNAC6基因長度909bp,編碼302個氨基酸,LpNAC20基因長度1986bp,編碼661個氨基酸。保守結(jié)構(gòu)與分析顯示,LpNAC6和LpNAC20基因均為NAC轉(zhuǎn)錄因子。熒光定量PCR的方法分析LpNAC6和LpNAC6和LpNAC20基因在各種非生物脅迫(高鹽、干旱、低溫和ABA)下的表達情況,發(fā)現(xiàn)LpNAC6和LpNAC20對高鹽和干旱脅迫比較敏感。2.成功構(gòu)建了中間載體pMD18-T-LpNAC6和pMD18-T-LpNAC20;雙酶切后和植物表達載體pBI121-GFP連接構(gòu)建植物表達載體pBI121-LpNAC6-GFP和pBI121-LpNAC20-GFP;利用基因槍法完成LpNAC6和LpNAC20基因在洋蔥表皮細胞中的亞細胞定位分析,結(jié)果顯示LpNAC6和LpNAC20基因均在細胞核中表達;利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將LpNAC6和LpNAC20基因成功整合到煙草基因組中并表達;根據(jù)轉(zhuǎn)LpNAC6和LpNAC20基因煙草T0代植株的表型強弱,各選出三個株系LpNAC6-2、LpNAC6-3、LpNAC6-5和LpNAC20-4、LpNAC20-6、LpNAC20-9,將它們的種子播種在選擇壓為50mg/L卡那霉素的1/2MS培養(yǎng)基上進行篩選,獲得轉(zhuǎn)基因T1代植株。3.分別觀察轉(zhuǎn)LpNAC6和LpNAC20基因和野生型煙草種子在鹽脅迫下的萌發(fā)率和幼苗生長情況。結(jié)果表明,鹽處理下轉(zhuǎn)基因LpNAC6和LpNAC20株系均表現(xiàn)出一定的耐受能力,種子萌發(fā)率和相對根長都大于野生型煙草。將成熟煙草植株(5～6片葉子)用300mmol/L NaC1處理15d后,野生型煙草出現(xiàn)黃化萎蔫及生長阻滯現(xiàn)象,而LpNAC6和LAC20基因過表達的轉(zhuǎn)基因煙草仍然正常生長,且轉(zhuǎn)基因植株的葉綠素、脯氨酸、可溶性蛋白的含量和超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶的活性均高于野生型植株。證明LpNAC6和LpNA0基因在煙草中的過表達能夠增強其對鹽肋迫的耐受性。
【學(xué)位單位】：東北林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S682.29
【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 緒論
    1.1 課題背景
    1.2 植物轉(zhuǎn)錄因子參與響應(yīng)逆境脅迫的研究
    1.3 關(guān)于NAC轉(zhuǎn)錄因子的研究進展
        1.3.1 NAC轉(zhuǎn)錄因子的功能研究
    1.4 細葉百合的研究進展
    1.5 研究的目的及意義
2 細葉百合LpNAC6、LpNAC20基因克隆及序列分析
    2.1 實驗材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 主要試劑及菌株
        2.1.3 主要儀器設(shè)備
        2.1.4 相關(guān)培養(yǎng)基及試劑的配制
    2.2 實驗方法
        2.2.1 細葉百合的總RNA的提取與鑒定
        2.2.2 細葉百合cDNA的合成
        2.2.3 LpNAC6和LpNAC20基因的克隆
        2.2.4 生物信息學(xué)分析
        2.2.5 細葉百合兩個NAC基因在非生物脅迫下的熒光定量分析
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 總RNA電泳檢測
        2.3.2 LpNAC6和LpNAC20基因的克隆與序列分析
        2.3.3 LpNAC6和LpNAC20基因的生物信息學(xué)分析
        2.3.4 LpNAC6和LpNAC20基因在四種非生物脅迫下的表達模式分析
    2.4 本章小結(jié)
3 LpNAC6和LpNAC20基因植物表達載體的構(gòu)建及對煙草的遺傳轉(zhuǎn)化
    3.1 實驗材料
        3.1.1 植物材料
        3.1.2 主要試劑及菌株
        3.1.3 主要儀器設(shè)備
        3.1.4 相關(guān)培養(yǎng)基及試劑的配制
    3.2 實驗方法
        3.2.1 加酶切位點中間表達載體的構(gòu)建
        3.2.2 植物表達載體的構(gòu)建
        3.2.3 大腸桿菌轉(zhuǎn)化及重組質(zhì)粒的驗證
        3.2.4 植物表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
        3.2.5 基因槍法轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細胞
        3.2.6 葉盤法轉(zhuǎn)化煙草
        3.2.7 轉(zhuǎn)基因煙草T1代的篩選
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 中間表達載體的構(gòu)建
        3.3.2 植物表達載體構(gòu)建
        3.3.3 農(nóng)桿菌菌液PCR鑒定
        3.3.4 LpNAC6和LpNAC20基因亞細胞定位檢測
        3.3.5 轉(zhuǎn)基因煙草的再生形態(tài)觀察
        3.3.6 轉(zhuǎn)LpNAC6和LpNAC20基因煙草的分子水平檢測
        3.3.7 轉(zhuǎn)LpNAC6和LpNACp20基因T1代煙草的獲得
    3.4 本章小結(jié)
4 轉(zhuǎn)LpNAC6和LpNAC20基因煙草的抗鹽性分析
    4.1 實驗材料
        4.1.1 植物材料
        4.1.2 主要試劑
        4.1.3 主要儀器設(shè)備
        4.1.4 相關(guān)培養(yǎng)基及試劑的配制
    4.2 實驗方法
        4.2.1 轉(zhuǎn)基因煙草株系種子在鹽脅迫下的抗性分析
        4.2.2 轉(zhuǎn)基因煙草在鹽脅迫下的生理指標測定
        4.2.3 數(shù)據(jù)處理
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 鹽脅迫對轉(zhuǎn)基因煙草種子萌發(fā)率的影響
        4.3.2 轉(zhuǎn)基因煙草株系的耐鹽性分析
    4.4 本章小結(jié)
5 討論
    5.1 LpNAC6和LpNAC20基因參與細葉百合非生物脅脅迫響應(yīng)
    5.2 LpNAC6和LpN4C20基因過表達可提高轉(zhuǎn)型基因煙草抗鹽性
結(jié)論
參考文獻
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
致謝
附件

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 蕭蓓蕾;劉麗霞;馮建英;;鹽脅迫對轉(zhuǎn)ZmPP2C2基因煙草和野生型煙草部分生理生化指標的影響[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2010年04期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 關(guān)春景;細葉百合3個NAC轉(zhuǎn)錄因子的克隆及其對煙草的遺傳轉(zhuǎn)化[D];東北林業(yè)大學(xué);2018年

2 夏寧;小麥抗條銹病相關(guān)NAC轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆及特征分析[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2010年

本文編號：2894666