發(fā)布時間：2020-11-19 02:23

　　 萬壽菊(Tagets erecta L.)舌狀花是提取葉黃素(Lutein)的優(yōu)質(zhì)植物源材料,其花色差異形成機理研究具重要意義。本論文以‘猩紅色’萬壽菊(‘Scarletade’)和‘非洲’萬壽菊(‘Marigold African’)(分別簡稱為‘2013-1’和‘2013-2’)舌狀花為試驗材料,采用高效液相色譜(HPLC)法檢測2個不同花色萬壽菊4個時期(S1期,未開花蕾;S2期,半開花蕾;S3期,開放的頭狀花序;S4期,完全開放的頭狀花序)類胡蘿卜素色素含量變化,Real-time PCR分析其生物合成與降解相關(guān)酶基因的表達特性,并利用同源克隆從萬壽菊中獲得類胡蘿卜素裂解雙加氧酶基因CCD1和CCD4b,探討萬壽菊舌狀花類胡蘿卜素代謝關(guān)鍵酶基因及花色形成差異的機理,研究結(jié)果如下:1萬壽菊舌狀花類胡蘿卜素色素含量分析HPLC技術(shù)檢測分析萬壽菊舌狀花4個發(fā)育時期番茄紅素、α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、玉米黃素和葉黃素的含量,結(jié)果表明:(1)2個品種舌狀花4個不同發(fā)育時期均檢測出葉黃素、玉米黃素、α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素4種代謝產(chǎn)物,而番茄紅素僅在‘2013-1’品種中檢出,表明2個品種均含有葉黃素及玉米黃素的2個代謝分支途徑。(2)2個品種中5種類胡蘿卜素含量‘2013-1’均高于或顯著高于‘2013-2’,其中β-胡蘿卜素含量顯著高于其它4種色素。在‘2013-1’品種S3期β-胡蘿卜素含量顯著低于其它3個時期,玉米黃素則最高且顯著高于其它時期;葉黃素S1期顯著低于其它3個時期,推測舌狀花4個時期的外觀顏色變化可能與玉米黃素、葉黃素和β-胡蘿卜素含量變化有關(guān)�！�2013-2’品種β-胡蘿卜素含量極顯著高于其它4種色素,且4個時期呈現(xiàn)先高后低的變化趨勢,葉黃素4個時期無顯著差異,α-胡蘿卜素和玉米黃素含量均低,未檢測出番茄紅素。2萬壽菊舌狀花類胡蘿卜素合成相關(guān)基因的表達分析采用Real-time PCR分析類胡蘿卜素代謝途徑所有生物合成相關(guān)酶基因,結(jié)果如下:(1)主通路5個基因表達分析結(jié)果顯示,PSY、CRTISO和Z-ISO 3個基因表達量變化趨勢與花色變化基本一致,但淺黃色‘2013-2’品種表達量均較深橙色‘2013-1’品種高;‘2013-1’中ZDS表達量S1期低于或顯著低于其它3個時期,且與番茄紅素含量呈高度正相關(guān),‘2013-2’ZDS表達量在S4期最高并顯著高于其它3個時期,但未檢測出番茄紅素;2個品種PDS-1表達量是PDS-2的10倍,在‘2013-2’PDS-2表達量除S1期外,極顯著高于‘2013-1’,而在‘2013-1’PDS-1高于或極顯著高于‘2013-2’。(2)玉米黃素支路中ZEP和NXS均在S3,S4期表達量較高,且2個品種之間存在顯著或極顯著差異,并與花色變化趨勢基本一致,可能是2個萬壽菊品種花色差異形成的關(guān)鍵因素;CHYB變化趨勢2個品種4個時期無明顯規(guī)律但與前人報道結(jié)果不同。(3)葉黃素支路中2個品種LCYe 4個時期變化差異不顯著,但與葉黃素含量變化趨勢基本一致,在‘2013-1’中兩者呈極顯著高度相關(guān),推測LCYe可能是葉黃素合成關(guān)鍵酶基因;2個品種CYP97A表達水平在S3期最高,并且該基因表達量與葉黃素含量變化呈中度相關(guān)或高度正相關(guān),推測CYP97A可能是葉黃素合成關(guān)鍵酶基因。3萬壽菊舌狀花類胡蘿卜素降解相關(guān)酶基因的表達分析(1)CCD家族利用Real-time PCR方法檢測萬壽菊花蕾轉(zhuǎn)錄組的7個CCD在2個品種4個不同時期基因表達量。結(jié)論如下:‘2013-1’CCD1 S1和S3期表達量最低,S4期極顯著高于其它時期,‘2013-2’CCD1相對表達量整體高于‘2013-1’且S3期存在極顯著差異,‘2013-1’CCD4a相對表達量與花色變化基本一致,但‘2013-2’品種則無明顯關(guān)系,2個品種CCD4b表達量S3和S4期均顯著高于前2個時期,CCD7在‘2013-2’4個時期表達量顯著高于‘2013-1’,而NCED2、NCED3和NCED5在‘2013-1’表達量顯著高于‘2013-2’,推測CCD1和CCD4b可能是2個萬壽菊品種花色差異形成的關(guān)鍵酶基因。(2)其它降解相關(guān)酶基因CCS在‘2013-2’中與β-胡蘿卜素含量變化趨勢基本一致,但在‘2013-1’無明顯相關(guān)性,推測其在‘2013-2’中可能與β-胡蘿卜素的生物合成有一定相關(guān)性。4 CCD基因克隆分析(1)克隆獲得萬壽菊CCD1基因(Gen Bank登陸號:KX557488)的c DNA全長序列為1 746 bp,編碼區(qū)長度1 623 bp,推測編碼541個氨基酸;蛋白質(zhì)分析表明Te CCD1為不穩(wěn)定蛋白,不含信號肽,屬RPE65超家族(登錄號:PF03055),包含CCD家族保守結(jié)構(gòu)域,主要定位于細胞質(zhì);萬壽菊CCD1核酸序列與除蟲菊CCD1基因同源性最高,為89%;氨基酸序列分析表明萬壽菊CCD1與除蟲菊同源性可高達93%,與其它19個不同種屬CCD1同源性在75%—83%之間,表明是Te CCD1是高度保守的基因;系統(tǒng)進化樹分析顯示Te CCD1的進化基本符合植物分類學的進化規(guī)律,并具有明顯的種屬特征,萬壽菊與菊科同源基因親緣關(guān)系最近。(2)利用同源基因克隆獲得CCD4b(Gen Bank登錄號:KY450708),序列分析表明Te CCD4b c DNA全長序列為1 725 bp,編碼區(qū)長度1 392 bp,推測編碼463個氨基酸;編碼的蛋白質(zhì)Te CCD4b功能主要定位于質(zhì)體膜,屬RPE65超家族,包含CCD家族保守的結(jié)構(gòu)域;同源分析表明Te CCD4b與向日葵Ha CCD4-L、案頭菊Cm CCD4b同源性最高;系統(tǒng)進化樹分析顯示Te CCD4b與Ha CCD4-L和Cm CCD4b親緣關(guān)系最近,與其它不同物種的CCD4和CCD4a存在差異,表明Te CCD4b在進化過程中保守性不強,且進化基本符合植物分類學的進化規(guī)律,不同種屬之間具有明顯差異。
【學位單位】：上海交通大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2017
【中圖分類】：S681.9
【部分圖文】：

圖 2-1 2 個萬壽菊品種舌狀花 4 個發(fā)育時期1-4 分別為‘2013-1’舌狀花 S1、S2、S3 和 S4 期5-8 分別為‘2013-2’舌狀花 S1、S2、S3 和 S4 期Fig.2-1 The developmental stages of Ray floret of two marigold varieties1-4：S1、S2、S3 and S4 stage of ray floret in ‘2013-1’;5-8: S1、S2、S3 and S4 stage of ray floretin ‘2013-2’2.1.2.2 標準品溶液的配制玉米黃素和葉黃素標準品用甲醇溶解，α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素標準品用甲基叔丁基醚溶解，番茄紅素標準品用正己烷溶解，除玉米黃素配成濃度為 50μg/mL，其余 4 種均配成 500 μg/mL 儲存液。2.1.2.3 色譜條件向旋蒸干的類胡蘿卜素樣品，加入 1 mL 正己烷，溶解后用有機濾膜（直徑 0.22 μm）過濾，上樣 200 μL，進樣 60 μL；

番茄紅素在本研究中的保留時間為 22.31min、24.11 min、30.82 min、32.20 min和 45.57 min，提取液出峰色譜圖（見圖 2-1、圖 2-2）。圖2-1 類胡蘿卜素標準樣品出峰時間色譜圖Fig.2-1 Chromatograms of carotenoid standard sample of different rentention times22.31min：葉黃素，24.11 min：玉米黃素，30.82 min：α-類胡蘿卜素，32.20 min：β-類胡蘿卜素，45.57 min：番茄紅素22.31min: Lutein, 24.11 min: Zeaxanthin, 30.82 min:α-carotene, 32.20 min: β-carotene

上海交通大學碩士學位論文13圖2-2 萬壽菊類胡蘿卜素提取物液相色譜圖Fig.2-2 Chromatograms of carotenoids extraction of different rentention times22.07 min：葉黃素，24.33 min：玉米黃素，31.22 min：α-類胡蘿卜素，32.12 min：β-類胡蘿卜素，46.07 min：番茄紅素22.07 min: Lutein, 24.33 min:Zeaxanthin, 31.22 min:α-carotene, 32.12 min: β-carotene,46.07 min: Lycopene2.2.2 花發(fā)育過程中類胡蘿卜素色素含量變化圖 2-3、2-4、2-5、2-6 和 2-7 顯示萬壽菊‘2013-1’和‘2013-2’品種舌狀花 4 個不同發(fā)育時期葉黃素、玉米黃素、α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素和番茄紅素的含量及變化，2 個品種花發(fā)育過程均檢出葉黃素、玉米黃素、α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素4 種代謝產(chǎn)物，番茄紅素在‘2013-1’品種中檢出，表明 2 個品種代謝途徑均含有葉黃素及玉米黃素的 2 個分支途徑。5 種類胡蘿卜素含量‘2013-1’均高于‘2013-2’
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本文編號：2889558