發(fā)布時(shí)間：2020-11-20 18:41

　　 螺原體隸屬于柔膜體綱,是一類無細(xì)胞壁、具有螺旋外形和運(yùn)動能力、基因組精簡的細(xì)小微生物。中華絨螯蟹螺原體Spiroplasma eriocheiris已經(jīng)被證實(shí)是導(dǎo)致中華絨螯蟹顫抖病的病原,是第一個(gè)在水生甲殼動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的螺原體類微生物,基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析表明,該病原與非凡螺原體Spiroplasma mirum有高達(dá)98%的相似度,S.mirum最初從兔虱蜱上分離得到,后被證實(shí)能感染脊椎動物剛出生幼體并誘發(fā)白內(nèi)障,還能利用雞胚增殖并最終導(dǎo)致雞胚死亡。與S.mirum相似的是,S.eriocheiris也具有感染乳鼠并導(dǎo)致白內(nèi)障病癥的能力(不能感染成年小鼠),感染雞胚時(shí)S.eriocheiris能通過雞胚卵黃囊傳播至體內(nèi)各組織,隨后出現(xiàn)在雞胚腦部。雖然螺原體感染脊椎動物的組織病理學(xué)證據(jù)很明顯,但其感染機(jī)制方面的報(bào)道卻很少�；�于課題組前期建立的S.eriocheiris感染小鼠胚胎成纖維細(xì)胞3T6的細(xì)胞感染模型,運(yùn)用表達(dá)譜芯片和microRNA芯片技術(shù)篩選3T6細(xì)胞被S.eriocheiris感染前后mRNA和miRNA的差異表達(dá),并用生物信息學(xué)方法及實(shí)驗(yàn)手段對芯片結(jié)果進(jìn)行聯(lián)合分析和功能驗(yàn)證。另一方面,應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)來篩選S.eriocheiris黏附蛋白ALP的互作蛋白,探討其在病原入侵宿主細(xì)胞過程中的作用,這些都將為闡述S.eriocheiris對宿主感染的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。1.基于表達(dá)譜芯片技術(shù)研究S.eriocheiri 侵染3T6細(xì)胞的機(jī)制為深入研究螺原體侵染3T6細(xì)胞的分子機(jī)制,我們進(jìn)行了表達(dá)譜芯片實(shí)驗(yàn),選取未感染和螺原體感染6 h后的3T6細(xì)胞,分兩組,每組3個(gè)平行,共6個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本,按表達(dá)譜芯片RNA質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn),提取了細(xì)胞的總RNA,用Agilent小鼠GE 4×44K v2芯片(包含39430個(gè)探針)進(jìn)行基因表達(dá)分析,按照表達(dá)譜芯片操作流程,對總RNA進(jìn)行了 cDNA反轉(zhuǎn)錄、熒光標(biāo)記、探針雜交及數(shù)據(jù)掃描等,采用MeV可視化軟件檢測差異表達(dá)探針確認(rèn)顯著差異表達(dá)基因,實(shí)驗(yàn)最終篩選出619個(gè)差異表達(dá)基因(183個(gè)上調(diào),436個(gè)下調(diào)),隨后使用DAVID在線數(shù)據(jù)庫對顯著差異表達(dá)基因進(jìn)行功能富集分析,并利用STING在線數(shù)據(jù)庫研究差異表達(dá)基因在蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中的分布情況,GO和KEGGpathway分析發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因集中在神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路、阿爾茨海默病、胰島素信號通路、黏著斑、軸突導(dǎo)向等14條信號通路上。2.S.eriocheiris侵染3T6細(xì)胞過程中差異microRNA的篩選miRNA芯片實(shí)驗(yàn)在杭州聯(lián)川生物公司完成,選用的是MRA-1002 miRmouse v20芯片,基于Sanger miRBase 20數(shù)據(jù)庫進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。每個(gè)芯片都包含多個(gè)控制探頭,PUC2PM-20B和PUC2MM-20B是單基匹配檢測探頭。RNA樣本為表達(dá)譜芯片同批的6個(gè)細(xì)胞總RNA,雜交前6組樣品分別添加了 20個(gè)堿基的陽性對照序列,PUC2PM-20B和PUC2MM-20B的強(qiáng)度比值大于20的列為差異條帶,用單因素方差分析計(jì)算P值,用Cluster 3.0和TreeView軟件來進(jìn)行聚類和主成分分析(PCA)。miRNA芯片共檢測出1982個(gè)3T6細(xì)胞miRNA,相較于對照組,被感染組3T6細(xì)胞有22個(gè)差異顯著的miRNA(8個(gè)上調(diào),14個(gè)下調(diào)),依據(jù)“種子”序列原則,我們用TargetScan、miRanda和PicTar三種軟件來預(yù)測差異miRNA的靶基因,綜合軟件分析結(jié)果,共獲得靶基因數(shù)量3781個(gè)。在這22個(gè)差異miRNA中,5個(gè)miRNA(2個(gè)上調(diào),3個(gè)下調(diào))信號強(qiáng)度小于500,以上結(jié)果說明螺原體侵染3T6細(xì)胞狀況下,宿主3T6細(xì)胞表現(xiàn)出一個(gè)獨(dú)特的miRNA表達(dá)模式。3.S.eriocheiris侵染3T6細(xì)胞RNA聯(lián)合分析及功能驗(yàn)證結(jié)合上述表達(dá)譜芯片和miRNA芯片結(jié)果進(jìn)行聯(lián)合分析,對比差異表達(dá)的miRNA靶基因和mRNA微陣列的差異表達(dá)基因,篩選出177個(gè)共同基因,并重點(diǎn)關(guān)注其中miRNA和mRNA變化負(fù)相關(guān)的共同基因進(jìn)行KEGG通路分析,結(jié)果表明,相關(guān)基因大量集中于黏附和MAPK信號通路,說明這兩個(gè)通路是螺原體感染宿主細(xì)胞的重要途徑。為了驗(yàn)證基因芯片的結(jié)果,從以上兩個(gè)通路中選取了 8個(gè)mRNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blotting驗(yàn)證實(shí)驗(yàn):黏附(β-Catenin、Parvin、Grb2 和 ERK);MAPK 信號通路(FGFR、Grb2、ERK、MKK3、p38和JNK),看家基因GAPDH作為對照。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得到的變化趨勢是β-Catenin(上調(diào))、Parvin(上調(diào))、FGFR(下調(diào)),ERK(下調(diào)),MKK3(下調(diào))、p38(下調(diào))芯片和RT-PCR結(jié)果趨勢是一致的,Grb2在微陣列分析中結(jié)果是下調(diào),但RT-PCR結(jié)果是沒有顯著變化,各基因免疫印跡結(jié)果與RT-PCR結(jié)果相吻合。同時(shí)也選取了 8 個(gè) miRNA(mir-143-3p,mir-214-5p,mir-322-3p,mir-328-5p,mir-351-5p,mir-466h-5p,mir-503-5p 和 mir-30c-1-3p)進(jìn)行 qPCR 驗(yàn)證,管家基因U6 miRNA作為對照,其中5個(gè)來自MAPK信號通路的miRNA均顯示上調(diào),其芯片和qPCR的結(jié)果得到了相互佐證。我們推測,當(dāng)3T6細(xì)胞被螺原體感染后MAPK信號通路被抑制,細(xì)胞正常代謝遭到破壞,使得病原更易感染細(xì)胞。4.S.eriochei i 黏附蛋白ALP在侵染3T6細(xì)胞過程中的作用利用免疫膠體金及Western blotting技術(shù)來對S.eriocheiris黏附蛋白ALP進(jìn)行定位,免疫電鏡觀察結(jié)果顯示ALP在螺原體的膜表面;將S.eriocheiris全蛋白、膜蛋白及胞質(zhì)蛋白分別與ALP多抗血清孵育后進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示全蛋白及膜蛋白有印跡條帶而胞質(zhì)蛋白則沒有,這與免疫電鏡結(jié)果相吻合。研究還發(fā)現(xiàn)ALP參與了螺原體侵染小鼠3T6細(xì)胞的過程,抗體中和實(shí)驗(yàn)顯示螺原體經(jīng)ALP多抗血清30 ℃孵育1 h后,再感染3T6細(xì)胞,36 h后進(jìn)入3T6細(xì)胞的螺原體顯著少于對照組,其侵染能力明顯減弱,說明黏附蛋白ALP這一螺原體表面蛋白,在螺原體入侵宿主細(xì)胞過程中起著關(guān)鍵作用。5.S.eriochei i 黏附蛋白ALP互作蛋白的篩選及功能鑒定利用酵母雙雜交技術(shù)篩選了能與螺原體黏附蛋白ALP相互作用的小鼠蛋白,結(jié)果顯示ALP可以與小鼠中的137個(gè)基因片段互作,選擇其中的纖連蛋白7(Fibulin7)進(jìn)行驗(yàn)證,原核重組表達(dá)后利用Far-western blotting確認(rèn)了 ALP與Fibulin7片段(含有兩個(gè)EGF結(jié)構(gòu)域)的相互作用,激光共聚焦確認(rèn)ALP與Fibulin7片段可以共定位。人工合成了 Fibulin7的另外兩個(gè)結(jié)構(gòu)域(EGF結(jié)構(gòu)域:136-172AA和補(bǔ)體控制蛋白CCP結(jié)構(gòu)域:81-134AA),結(jié)果顯示僅Fibulin7的EGF結(jié)構(gòu)域能與ALP結(jié)合,由于EGF結(jié)構(gòu)域與EGF有高度同源性,而EGF是EGFR信號通路重要的上游信號分子,當(dāng)ALP重組蛋白刺激3T6細(xì)胞后,ALP與EGF競爭性結(jié)合而使得EGFR通路被抑制。未出生的小鼠、新生乳鼠和乳鼠期接種螺原體后成年患白內(nèi)障的小鼠體內(nèi)都檢測出Fibulin7基因的表達(dá),而正常成年小鼠則沒有,新生乳鼠大腦部位含有豐富的EGF,ALP通過與EGF的互作促成了 S.eriocheiris對乳鼠的感染。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)S.eriocheiri 外膜蛋白ALP在其侵染哺乳動物細(xì)胞中起關(guān)鍵作用。FBLN7蛋白的EGF結(jié)構(gòu)域是ALP作用的識別位點(diǎn),ALP通過與EGF結(jié)構(gòu)域結(jié)合進(jìn)而與宿主細(xì)胞相結(jié)合,ALP促進(jìn)了病原菌與宿主細(xì)胞的黏附及后續(xù)的侵染過程。
【學(xué)位單位】：南京師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S945
【部分圖文】：

來進(jìn)行細(xì)胞死亡的判斷。用碘化丙啶（ＰＩ）進(jìn)行細(xì)胞染色，在熒光顯微鏡的激發(fā)下，??正常貼壁的細(xì)胞沒有出現(xiàn)任何顏色，漂浮著的細(xì)胞顯現(xiàn)出紅色，表明這些細(xì)胞已??經(jīng)死亡（如圖２．１）。??Ｍ??圖２．１⑷正常３Ｔ６細(xì)胞；（Ｂ）中華絨螯蟹螺原體感染３Ｔ６細(xì)胞２４ｈ；?（Ｃ）用碘化丙啶（ＰＩ）染色??感染螺原體２４?ｈ后的３Ｔ６細(xì)胞，死亡細(xì)胞被染成紅色，而活細(xì)胞不能被染色（２〇ｘ）。標(biāo)尺：??２０?ｊｉｍ〇??Ｆｉｇ．?２．１?（Ａ）?ｎｏｒｍａｌ?３Ｔ６?ｃｅｌｌｓ；?（Ｂ）?３Ｔ６?ｃｅｌｌｓ?ｉｎｆｅｃｔｅｄ?ｗｉｔｈ?Ｓ．?ｅｒｉｏｃｈｅｉｒｉｓ?ａｆｔｅｒ?２４?ｈ；?（Ｃ）?３Ｔ６?ｃｅｌｌｓ??ｉｎｆｅｃｔｅｄ?ｗｉｔｈ?Ｓ．?ｅｒｉｏｃｈｅｉｒｉｓ?ａｆｔｅｒ?２４?ｈ，?ａｐｏｐｔｏｔｉｃ?ｃｅｌｌｓ?ｗｅｒｅ?ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ?ｂｙ?ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ?ｉｏｄｉｄｅ?（ＰＩ）??ｓｔａｉｎ．?Ｂａｒ：?２０?｜ａｍ??用流式細(xì)胞技術(shù)來分析誘導(dǎo)３Ｔ６細(xì)胞凋亡的情況，結(jié)果如圖??２．２Ａ所示，Ｓ：?ｍｋ／ｚｅ／Ｗｓ感染３Ｔ６細(xì)胞４８?ｈ后能明顯的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。樣品經(jīng)??過Ａｎｎｅｘｉｎ?Ｖ和ＰＩ雙重染色標(biāo)記后，定量分析結(jié)果如圖２．２Ｃ、Ｄ所示，與對照??組相比，Ｘ?ｅｈｏｃ／ｚｅ／ｒｋ病原菌刺激３Ｔ６細(xì)胞４８?ｈ后凋亡細(xì)胞的百分率顯著增加（ｐ??＜０．０５）。如圖２．２Ｅ所示，細(xì)胞活力也明顯低于對照組（無病原菌刺激）。??２７??

來進(jìn)行細(xì)胞死亡的判斷。用碘化丙啶（ＰＩ）進(jìn)行細(xì)胞染色，在熒光顯微鏡的激發(fā)下，??正常貼壁的細(xì)胞沒有出現(xiàn)任何顏色，漂浮著的細(xì)胞顯現(xiàn)出紅色，表明這些細(xì)胞已??經(jīng)死亡（如圖２．１）。??Ｍ??圖２．１⑷正常３Ｔ６細(xì)胞；（Ｂ）中華絨螯蟹螺原體感染３Ｔ６細(xì)胞２４ｈ；?（Ｃ）用碘化丙啶（ＰＩ）染色??感染螺原體２４?ｈ后的３Ｔ６細(xì)胞，死亡細(xì)胞被染成紅色，而活細(xì)胞不能被染色（２〇ｘ）。標(biāo)尺：??２０?ｊｉｍ〇??Ｆｉｇ．?２．１?（Ａ）?ｎｏｒｍａｌ?３Ｔ６?ｃｅｌｌｓ；?（Ｂ）?３Ｔ６?ｃｅｌｌｓ?ｉｎｆｅｃｔｅｄ?ｗｉｔｈ?Ｓ．?ｅｒｉｏｃｈｅｉｒｉｓ?ａｆｔｅｒ?２４?ｈ；?（Ｃ）?３Ｔ６?ｃｅｌｌｓ??ｉｎｆｅｃｔｅｄ?ｗｉｔｈ?Ｓ．?ｅｒｉｏｃｈｅｉｒｉｓ?ａｆｔｅｒ?２４?ｈ，?ａｐｏｐｔｏｔｉｃ?ｃｅｌｌｓ?ｗｅｒｅ?ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ?ｂｙ?ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ?ｉｏｄｉｄｅ?（ＰＩ）??ｓｔａｉｎ．?Ｂａｒ：?２０?｜ａｍ??用流式細(xì)胞技術(shù)來分析誘導(dǎo)３Ｔ６細(xì)胞凋亡的情況，結(jié)果如圖??２．２Ａ所示，Ｓ：?ｍｋ／ｚｅ／Ｗｓ感染３Ｔ６細(xì)胞４８?ｈ后能明顯的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。樣品經(jīng)??過Ａｎｎｅｘｉｎ?Ｖ和ＰＩ雙重染色標(biāo)記后，定量分析結(jié)果如圖２．２Ｃ、Ｄ所示，與對照??組相比，Ｘ?ｅｈｏｃ／ｚｅ／ｒｋ病原菌刺激３Ｔ６細(xì)胞４８?ｈ后凋亡細(xì)胞的百分率顯著增加（ｐ??＜０．０５）。如圖２．２Ｅ所示，細(xì)胞活力也明顯低于對照組（無病原菌刺激）。??２７??

結(jié)合（ｐｕｒｉｎｅ?ｒｍｃｌｅ６ｔｉｄｅ?ｂｉｎｄｉｎｇ）２１％、核糖核苷酸結(jié)合（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ?ｂｉｎｄｉｎｇ）和喔??呤核糖核苷酸結(jié)合（ｐｕｒｉｎｅ?ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ?ｂｉｎｄｉｎｇ）各?２０％、ＫＮＡ?結(jié)合（ＲＮＡ??ｂｉｎｄｉｎｇ）１０°／〇等共７個(gè)分類。具體分析情況見下圖（
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本文編號：2891825