發(fā)布時(shí)間：2020-11-20 03:18

　　 團(tuán)頭魴(Megalobrama amblycephala)是我國(guó)特有的經(jīng)濟(jì)淡水魚(yú)類(lèi)之一,但是隨著團(tuán)頭魴養(yǎng)殖密度的增加以及養(yǎng)殖環(huán)境的惡化,導(dǎo)致其抗病能力降低,病害頻發(fā),尤其是由嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)感染引起的細(xì)菌性敗血癥嚴(yán)重影響了團(tuán)頭魴養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展,造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,為了解決魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖中病害多發(fā)的問(wèn)題,越來(lái)越多的研究學(xué)者開(kāi)始研究魚(yú)類(lèi)的免疫應(yīng)答反應(yīng)及其調(diào)控機(jī)制。因此,本研究通過(guò)對(duì)團(tuán)頭魴Toll樣受體(toll like receptors,tlrs)及干擾素調(diào)節(jié)因子(interferon regulatory factors,irfs)基因表達(dá)及其功能等方面進(jìn)行分析,有利于掌握其在調(diào)節(jié)團(tuán)頭魴抗細(xì)菌免疫應(yīng)答中的作用,為魚(yú)類(lèi)細(xì)菌性疾病的預(yù)防和治療提供基礎(chǔ)參考資料。本研究主要結(jié)果如下:1.鑒定出4個(gè)能夠特異性識(shí)別細(xì)菌組分的tlrs基因,分別為團(tuán)頭魴tlr5a(Matlr5a)、Matlr5b、Matlr9和Matlr21。序列分析表明,4個(gè)MaTlrs都具有典型的TLR蛋白結(jié)構(gòu)特征,包括胞外LRR(Leucine-rich repeat)結(jié)構(gòu)區(qū)域,胞內(nèi)TIR(Toll/interleukin-1 receptor)結(jié)構(gòu)區(qū)域及跨膜TM(Transmembrane)結(jié)構(gòu)區(qū)域,并預(yù)測(cè)了胞外LRRCT結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)TIR結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)3D結(jié)構(gòu),分析發(fā)現(xiàn)二者均呈現(xiàn)較為保守的結(jié)構(gòu)特征,并且LRRCT結(jié)構(gòu)域符合α螺旋和β折疊串聯(lián)結(jié)構(gòu)的特征。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示MaTlr5a、MaTlr5b、MaTlr9和MaTlr21分別屬于TLR5亞家族,TLR7亞家族和TLR11亞家族。利用熒光定量PCR方法檢測(cè)Matlr5a、Matlr5b、Matlr9和Matlr21基因在組織中的表達(dá)量,結(jié)果顯示,其在所有檢測(cè)的組織中均有表達(dá),并且在免疫器官和淋巴樣組織中的表達(dá)量相對(duì)較高。此外研究還發(fā)現(xiàn),嗜水氣單胞菌可以有效的誘導(dǎo)Matlr5a、Matlr5b、Matlr9和Matlr21基因在感染后團(tuán)頭魴的肝臟、脾臟、腎臟、腸和鰓中上調(diào)表達(dá)。2.克隆得到11個(gè)團(tuán)頭魴irfs(Mairfs)基因,利用Clustal W和SMART在線分析蛋白質(zhì)序列特征,結(jié)果顯示,這11個(gè)蛋白質(zhì)都屬于非跨膜蛋白并且無(wú)信號(hào)肽序列,除了MaIrf1和MaIrf2,其余MaIrfs都含有兩個(gè)保守功能域:IRF和IRF3功能域。預(yù)測(cè)11個(gè)MaIrfs蛋白質(zhì)的氨基端和羧基端3D結(jié)構(gòu),結(jié)果顯示,同一家族的Irfs因子蛋白質(zhì)的氨基端結(jié)構(gòu)幾乎一樣,顯示出極高的保守性。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示11個(gè)MaIrfs分別屬于IRF1亞家族,IRF3亞家族,IRF4亞家族和IRF5亞家族。利用熒光定量PCR方法檢測(cè)了11個(gè)Mairfs基因在組織中的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)其在所有檢測(cè)的組織均有表達(dá),而且在免疫器官和淋巴樣組織中的表達(dá)量相對(duì)較高。研究還發(fā)現(xiàn),嗜水氣單胞菌感染團(tuán)頭魴后,可以有效的調(diào)控這些基因在肝臟、脾臟、腎臟、腸和鰓中的表達(dá)變化,參與機(jī)體抗嗜水氣單胞菌的免疫應(yīng)答。通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)獲得團(tuán)頭魴核因子κB抑制蛋白β(MaIκB-β)可溶性蛋白,以及MaIrf1和MaIrf2不可溶蛋白,并對(duì)其進(jìn)行抗菌性試驗(yàn),結(jié)果顯示獲得的MaIκB-β可溶性蛋白在體外試驗(yàn)中并沒(méi)有抗菌作用,但Western-Blot(WB)和Immuno-Fluorescence(IF)試驗(yàn)結(jié)果顯示在嗜水氣單胞菌感染的過(guò)程中,干擾素調(diào)節(jié)因子與炎癥因子都參與了抗菌免疫應(yīng)答。3.通過(guò)構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒,在鯉EPC細(xì)胞研究了團(tuán)頭魴4個(gè)Matlrs在信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中功能的相似性及差異性,利用GFP融合蛋白對(duì)其進(jìn)行亞細(xì)胞定位,激光共聚焦結(jié)果顯示MaTlr5a、MaTlr5b、MaTlr9和MaTlr21蛋白質(zhì)都位于細(xì)胞質(zhì)中,其中MaTlr5a和MaTlr5b與早期內(nèi)涵體和晚期內(nèi)涵體位于不同位置,而MaTlr9和MaTlr21與早期內(nèi)涵體和晚期內(nèi)涵體都位于同一位置。利用過(guò)表達(dá)載體研究Matlr5a、Matlr5b、Matlr9和Matlr21全長(zhǎng)基因?qū)Ω蓴_素相關(guān)免疫因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,結(jié)果表明其均能誘導(dǎo)irf3、irf7、isg15、mx1、pkr和viperin的上調(diào),說(shuō)明團(tuán)頭魴4個(gè)Matlrs的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程是相似的,但是其上調(diào)的時(shí)間與上調(diào)基因表達(dá)量的程度是不同的,對(duì)viperin、isg15和irf7上調(diào)程度較高,pkr上調(diào)程度最小,而且Matlr5b最先調(diào)控干擾素通路,可能發(fā)揮主要功能,Matlr21最后調(diào)控,可能在信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮輔助作用。因此它們?cè)趫?zhí)行功能中可能有差異,但是都能夠參與機(jī)體抗病原體的免疫應(yīng)答。4.利用克隆方法獲得6個(gè)Mairfs啟動(dòng)子序列,序列分析發(fā)現(xiàn)其啟動(dòng)子序列中都有核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)位點(diǎn)。利用雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)探究了Matlrs對(duì)Mairfs啟動(dòng)子的調(diào)控關(guān)系,而且在人類(lèi)293T細(xì)胞和鯉EPC細(xì)胞這兩種細(xì)胞系中得到的結(jié)果相似,說(shuō)明此信號(hào)傳遞的過(guò)程不受物種限制。雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)結(jié)果顯示團(tuán)頭魴Matlr5a和Matlr9能夠促進(jìn)Mairf7啟動(dòng)子活性,但是不能促進(jìn)其他基因的啟動(dòng)子活性;Mairf5b能夠促進(jìn)Mairf1和Mairf7啟動(dòng)子的活性,而Matlr21并不能促進(jìn)任何Mairfs啟動(dòng)子活性,說(shuō)明Matlrs對(duì)Mairfs啟動(dòng)子的調(diào)控較為復(fù)雜。利用細(xì)胞凋亡試驗(yàn)研究過(guò)表達(dá)Matlr5a、Matlr5b、Matlr9和Matlr21后,在細(xì)菌感染細(xì)胞過(guò)程中對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控,試驗(yàn)結(jié)果顯示MaTlr5a,MaTlr9和MaTlr21都能夠在一定程度上抑制了細(xì)胞凋亡,而MaTlr5b在一定程度上促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。綜上所述,在團(tuán)頭魴Matlr5a、Matlr5b、Matlr9和Matlr21以及Mairf1、Mairf2、Mairf3、Mairf4a、Mairf4b、Mairf5、Mairf6、Mairf7、Mairf8、Mairf9和Mairf10在抵抗嗜水氣單胞菌感染過(guò)程中能夠調(diào)控機(jī)體免疫,通過(guò)二者的相互作用,能夠更好的保護(hù)機(jī)體免受病原體的入侵,但是Matlr5a、Matlr5b、Matlr9和Matlr21在信號(hào)傳導(dǎo)及行使功能過(guò)程中具有一定的差異,這為進(jìn)一步探究魚(yú)類(lèi)Tlr及Irf信號(hào)通路在抗細(xì)菌過(guò)程中的調(diào)控奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：S917.4
【部分圖文】：

團(tuán)頭魴 tlrs 及 irfs 基因的克隆、表達(dá)及其功能研究據(jù) TLRs 識(shí)別的 PAMPs 不同，其細(xì)胞定位也不同，且具有特異性。 般原體表成分的 TLRs 都定位在細(xì)胞膜上，而識(shí)別病原核酸成分的 TLR器膜上（如內(nèi)體膜）（AgrawalandKandimalla2007），如 TLR3、7、8、化的細(xì)胞定位，對(duì) TLRs 與特異性配體結(jié)合及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)都起到作用（BartonandKagan2009）。盡管魚(yú)類(lèi)有 些特殊的 Tlr 存在，但是物中 TLR 級(jí)聯(lián)招募的下游接頭分子相似并且信號(hào)傳導(dǎo)功能 致（圖 1家對(duì)比較低等脊椎動(dòng)物和哺乳動(dòng)物先天和適應(yīng)性免疫防御機(jī)制的研究。

RAM 和 SARM（Akira et al 2006）。所有的 IRFs 氨基端均包含 D，能夠識(shí)別干擾素及干擾素刺激基因相似的DNA序列（Escalante TLR 介導(dǎo)的下游信號(hào)通路主要是兩條：MyD88 依賴(lài)型和 MyD88-TRIF 依賴(lài)途徑）信號(hào)通路，所有 TLRs 均激活 MyD88 依賴(lài)通路3 和 TLR4 還可以激活 MyD88 非依賴(lài)通路。比如，TLR4 在 MyD88 非依賴(lài)型信號(hào)通路中均能發(fā)揮作用，TLR4 可以通過(guò)誘導(dǎo) MyD激活 IFN-β 的產(chǎn)生，如果沒(méi)有完全激活，則可以通過(guò) MyD88 非依在 TLR4 調(diào)控炎癥細(xì)胞因子誘導(dǎo)基因（如 TNF 和 IL-6）活化時(shí)，途徑來(lái)完全激活。而且這兩條途徑都與下游的兩條信號(hào)通路的活 MAPK 信號(hào)通路。前有大量研究表明， 些 IRF 家族成員也能被 MyD88 依賴(lài)和 My活，并對(duì) TLRs 誘導(dǎo)的特定基因的表達(dá)起到協(xié)同作用，所以，IRFs TRIF 依賴(lài)型信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用（圖 1-2）。

表Matlr9-qF CACAACCGCATTGACCTGTATlr9Matlr9-qR CGATGTCCCATACCCTTCATMatlr21-qF TCGCAGTGAATGGTGCTCTlr21Matlr21-qR GGACAGTTGCCGCTTAGGTAβ-actin-F ACCCACACCGTGCCCATCTAβ-actinβ-actin-R CGGACAATTTCTCTTTCGGCTGMatlr5a-F ATGGCAACAAGATGCACTTTATCTTlr5aPCRMatlr5a-R TTACACTGCAGTGTCTGCTTGCAMatlr5b-F ATGGGATTTACATTCATTCTGATCCTlr5bMatlr5b-R TTATACTGCTGTGTTTGCATGGACAMatlr9-F ATGTTTGGATACGTGTATTTGATTCTCTlr9Matlr9-R TTAGAAGAAGCTCTCTATGACATTTTTGMatlr21-F ATGGCAGCTTCTGCATGTCGTlr21Matlr21-R TCAGGGCATTAGGTAATACTCTTCC
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2890861