發(fā)布時(shí)間：2020-11-23 15:55

　　 顛茄(Atropa belladonna L.)是茄科顛茄屬的一種藥用植物,全草可入藥。主要次生代謝產(chǎn)物為托品烷類(lèi)生物堿(Tropane Alkaloids,TAs),其中莨菪堿和東莨菪堿是應(yīng)用最為廣泛的兩種,多制成注射劑或片劑作為抗膽堿藥物使用,藥效包括止痙、鎮(zhèn)痛、止吐、麻醉、治療帕金森癥、抗暈動(dòng)癥等,市場(chǎng)需求量巨大。但由于顛茄植株中莨菪堿和東莨菪堿的含量極低,提取方法復(fù)雜且純度不高,使其產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于市場(chǎng)需求。因此,提高顛茄次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量是顛茄研究的重點(diǎn)方向。其中,通過(guò)誘導(dǎo)子刺激顛茄毛狀根加速合成次生代謝產(chǎn)物的方式效果良好且成本較低,所以又是顛茄次生代謝研究的熱點(diǎn)。本試驗(yàn)以顛茄毛狀根為研究材料,采用向其培養(yǎng)基中添加適宜濃度的真菌誘導(dǎo)子酵母提取物(Yeast extract,YE)的處理方式,測(cè)定了顛茄毛狀根碳代謝、氮代謝、抗氧化代謝以及托品烷類(lèi)生物堿代謝的相關(guān)指標(biāo),以分析YE對(duì)顛茄毛狀根生長(zhǎng)代謝的影響情況,并初步探究YE對(duì)顛茄毛狀根托品烷類(lèi)生物堿代謝的調(diào)控機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:1.比較不同濃度YE對(duì)顛茄毛狀根兩種主要生物堿產(chǎn)量的影響,結(jié)果表明:YE濃度為100 mg·L~(-1)時(shí),莨菪堿和東莨菪堿能夠在短期內(nèi)高效積累,而添加更高YE濃度如300 mg·L~(-1),則會(huì)使顛茄毛狀根莨菪堿和東莨菪堿產(chǎn)量降低,YE濃度為400mg·L~(-1)時(shí)甚至可導(dǎo)致顛茄毛狀根死亡。2.研究YE對(duì)顛茄毛狀根碳代謝的影響,結(jié)果表明:對(duì)照組顛茄毛狀根的碳代謝在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中幾乎處于相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài),YE的添加使毛狀根的淀粉酶活性顯著增強(qiáng),蔗糖合成酶活性先升后降,總碳含量顯著升高,可溶性糖含量變化并不顯著。這說(shuō)明YE改變了顛茄毛狀根原有的碳代謝調(diào)節(jié)方式,使整個(gè)碳代謝更加活躍。3.研究YE對(duì)顛茄毛狀根氮代謝的影響發(fā)現(xiàn):較對(duì)照組而言,顛茄毛狀根中硝態(tài)氮、銨態(tài)氮含量顯著下降,其他含氮化合物可溶性蛋白、游離氨基酸含量顯著升高,總氮含量同樣也有顯著的增多,硝酸還原酶(NR)和谷氨酰胺合成酶(GS)活性均顯著升高,但谷氨酸脫氫酶(GDH)活性變化不顯著。說(shuō)明YE加速了毛狀根的氮代謝,增強(qiáng)了氮同化,使更多的無(wú)機(jī)氮轉(zhuǎn)變?yōu)橛袡C(jī)氮提供給植物利用。4.研究YE對(duì)顛茄毛狀根抗氧化代謝的影響,結(jié)果顯示:毛狀根能通過(guò)增強(qiáng)各種抗氧化酶的活性來(lái)清除體內(nèi)隨衰老產(chǎn)生的多余活性氧,以維持正常的生長(zhǎng)代謝。YE的添加可使過(guò)氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性較對(duì)照組顯著降低,說(shuō)明毛狀根中的活性氧含量降低,避免了活性氧對(duì)植物細(xì)胞產(chǎn)生傷害。5.研究YE對(duì)顛茄毛狀根托品烷類(lèi)生物堿代謝的影響發(fā)現(xiàn):YE處理顛茄毛狀根可顯著提高托品烷類(lèi)生物堿代謝途徑中的底物氨基酸(鳥(niǎo)氨酸和精氨酸)的含量以及腐胺的含量,代謝途徑中的關(guān)鍵酶基因1,4-丁二氨-氮-甲基轉(zhuǎn)移酶基因(Putrescine N-methyl transferase,PMT)、托品酮還原酶-I基因(Tropinone reductase-I,TR I)和莨菪堿6-β-羥化酶基因(hyoscyamine 6-β-hydroxylase,H6H)的相對(duì)表達(dá)量也呈現(xiàn)不同幅度的上升,最終使產(chǎn)物莨菪堿和東莨菪堿產(chǎn)量增多,本試驗(yàn)結(jié)果中,莨菪堿產(chǎn)量比東莨菪堿產(chǎn)量增幅更大,在處理16 d后分別是對(duì)照組的3.09倍和1.85倍。綜上所述,YE對(duì)顛茄毛狀根的氮代謝和抗氧化代謝均產(chǎn)生了一定的影響,但主要是增強(qiáng)了顛茄毛狀根氮代謝關(guān)鍵酶活性使氮代謝加速,生成的氨基酸可為次生代謝中托品烷類(lèi)生物堿的合成提供更多原料,同時(shí)YE還通過(guò)調(diào)控托品烷類(lèi)生物堿代謝途徑中關(guān)鍵酶基因的表達(dá),使莨菪堿和東莨菪堿產(chǎn)量提高。本研究為實(shí)際生產(chǎn)中提高顛茄有效藥用成分產(chǎn)量提供了很好的參考,也為繼續(xù)開(kāi)展顛茄托品烷類(lèi)生物堿代謝工程提供了一定的理論支持。
【學(xué)位單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：S567.239
【部分圖文】：

西南大學(xué)碩士學(xué)位論文學(xué)者關(guān)注的問(wèn)題。1.5.2 托品烷類(lèi)生物堿的代謝途徑托品烷類(lèi)生物堿合成代謝的上游途徑：以鳥(niǎo)氨酸（Ornithine）或精氨酸（Arginine）為最初底物，鳥(niǎo)氨酸通過(guò)鳥(niǎo)氨酸脫羧酶（ODC）催化生成腐胺（Put）；或是精氨酸通過(guò)精氨酸脫羧酶（ADC）的催化生成 N-氨基甲酰腐胺，再通過(guò)反應(yīng)生成腐胺。腐胺是托品烷類(lèi)生物堿代謝途徑中十分關(guān)鍵的化合物，又被稱(chēng)為托品烷類(lèi)生物堿代謝的前體化合物[69,70]。

與設(shè)備tler-Toledo 十萬(wàn)分之一電子天平；HIRYAMAHVE-50 高壓滅菌鍋；志蕩器 ZWY-2102C（上海志城分析儀器有限公司）；日本島津（Shima高效液相色譜儀；雪花制冰機(jī) FM40（北京長(zhǎng)流科學(xué)儀器有限公司 純水系統(tǒng)等。與分析茄毛狀根的生長(zhǎng)情況基中添加了不同濃度 YE 的毛狀根在培養(yǎng)過(guò)程中出現(xiàn)了不同的生長(zhǎng)情外，各組生長(zhǎng)情況良好。T4 組（YE 濃度最高組）4 d（圖 3-1 B）根點(diǎn)，6 d（圖 3-1 C）整個(gè)根體逐漸變黑，8 d（圖 3-1 D）已經(jīng)出現(xiàn)腐說(shuō)明 T4 組 YE 濃度對(duì)于顛茄毛狀根已經(jīng)過(guò)高，不利于毛狀根的生長(zhǎng)其死亡（圖 3-1）。（圖 3-1 A 為 CK 組 8 d 正常生長(zhǎng)的毛狀根）A B

圖 3-2 YE 對(duì)顛茄毛狀根莨菪堿產(chǎn)量的影響Fig.3-2 Effects of YE on hyoscyamine yield of Atropa belladonna L. hairy roots注：不同字母表示不同濃度 YE 處理間差異顯著（p＜0.05）下同。Note: Different letters indicate significant differences under YE treatment with different concentration (p <0.05), The same below.
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