【摘要】：重復(fù)序列在小麥族物種基因組中占很高的比例,在普通小麥中國春基因組中含量高達85%以上,但基因組中重復(fù)序列的結(jié)構(gòu)與功能研究較為薄弱。重復(fù)序列可分為串聯(lián)重復(fù)(Tandem repeats,TR)和散在重復(fù)(Interspersed repeats,IR),僅少數(shù)TR在分子標(biāo)記、進化研究和細胞遺傳學(xué)分析中得到應(yīng)用。近年來,隨著基因組測序與組裝技術(shù)的提升以及成本的下降,小麥族中多個物種的基因組序列的完成,為從全基因組水平上分析小麥及其近緣物種的TR的結(jié)構(gòu)與功能,以及大規(guī)模開發(fā)TR探針應(yīng)用于染色體精細鑒定等提供了基礎(chǔ)。本研究基于小麥及其近緣物種的參考基因組,結(jié)合基因組學(xué)和分子細胞遺傳學(xué)手段,明確了基因組中的TR分布特征,發(fā)掘了一批新的寡核苷酸(Oligo)探針,能夠在小麥染色體上產(chǎn)生清晰穩(wěn)定的熒光原位雜交(Florescent in situ hybridization,FISH)雜交信號,并利用新探針對小麥易位染色體片段進行了精細鑒定。研究結(jié)果如下:1、基因組TR分布可視化網(wǎng)絡(luò)服務(wù)工具的建立。針對串聯(lián)重復(fù)序列家族在基因組中的物理特征,基于BLAST,我們構(gòu)建了TR富集與物理分布網(wǎng)絡(luò)服務(wù)B2DSC(http://mcgb.uestc.edu.cn/b2dsc)。B2DSC作為TR分布可視化工具,實現(xiàn)了基于TR設(shè)計FISH寡核苷酸探針的預(yù)評估,并對FISH雜交信號進行物理定位。同時基于FISH雜交結(jié)果,評估參考基因組局部區(qū)段重復(fù)序列的拼裝質(zhì)量,為細胞遺傳學(xué)分析改進復(fù)雜基因組質(zhì)量提供指導(dǎo)。2、小麥及近緣物種參考基因組的TR發(fā)掘。建立了包括小麥(AABBDD)、烏拉爾圖小麥(AA)、節(jié)節(jié)麥(DD)、野生二粒小麥(AABB)和栽培大麥(HH)物種的非冗余TR(non-redundant TR,NR-TR)全基因組分布數(shù)據(jù)庫(http://mcgb.uestc.edu.cn/tr)。發(fā)現(xiàn)小麥各染色體TR含量在2-5%之間,在A、B和D組染色體上非均勻分布,以D組染色體的TR密度最高。明確了小麥基因組中不同長度TR陣列在基因組的分布與富集特征,說明重復(fù)序列結(jié)構(gòu)多樣性對小麥基因組進化發(fā)揮了重要作用。3、小麥基因組TR與基因表達調(diào)控分析。發(fā)現(xiàn)1-10 bp TR和31-60 bp TR分別在高置信度(high confidence,HC)基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(transcription start site,TSS)上下游50 bp和基因轉(zhuǎn)錄終止位點(transcription terminal site,TTS)下游500bp內(nèi)相對較高富集。在TSS上游1 Kb內(nèi)和TTS下游300 bp內(nèi)出現(xiàn)50拷貝以上TR陣列的HC基因,常常表現(xiàn)為完全不表達或有中低表達。類萌發(fā)素蛋白基因家族分析,發(fā)現(xiàn)編碼區(qū)插入了TR的基因完全不表達。對93個低拷貝TR陣列的基因分析,表現(xiàn)了潛在的pre-miRNA序列的存在,為開展TR對全基因組的表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究奠定了基礎(chǔ)。4、基于高拷貝TR的寡核苷酸原位雜交探針的發(fā)掘。在TR全基因組分析的基礎(chǔ)上,開展TR陣列的聚類分析,從46類小麥高拷貝TR以及3類大麥TR中獲得了16個新寡核苷酸探針。驗證發(fā)現(xiàn)它們在小麥染色體上有比較清晰穩(wěn)定的非變性熒光原位雜交(nondenaturing FISH,ND-FISH)雜交信號,且結(jié)合B2DSC進行的基因組物理定位,構(gòu)建了一張TR探針的染色體物理定位整合圖譜,大大提高了FISH鑒定小麥及其近緣屬物種染色體特定區(qū)段的分辨率。5、小麥高富集的小衛(wèi)星(minisatellite)序列的分布與進化研究。小麥基因組中一類44 bp的TR序列Ta-3A1,共有69,135個拷貝,總長約3.02 Mb,為拷貝數(shù)最高的小衛(wèi)星序列。Ta-3A1主要富集于小麥3AL、5AL、7AS、7AL、5BL和5DS很短的區(qū)間內(nèi)。序列的聚類分析與物理分布分析,結(jié)合小麥族代表性物種染色體的比較ND-FISH分析,發(fā)現(xiàn)Ta-3A1拷貝數(shù)和染色體位置的快速變化,與小麥族物種形成和多倍體化過程中的染色體重排事件有關(guān)。6、基于TR的寡核苷酸探針用于染色體結(jié)構(gòu)變異精準(zhǔn)鑒定。利用發(fā)掘的Oligo探針,對小麥-偃麥草導(dǎo)入系Z4、小麥-黑麥-偃麥草易位系品種Amigo以及“川麥62”的染色體進行了多重探針的FISH分析。準(zhǔn)確鑒定了Z4的易位染色體(Tr-I)的易位斷點,其中3A的斷點確定在位于長臂的532.13 Mb區(qū)域,3DS的47 Mb區(qū)段插入到Tr-I的端部。FISH鑒定發(fā)現(xiàn)小麥品種Amigo具有小麥-黑麥1RS.1AL易位染色體,小麥7BS.7AS和7BL.7AL易位,還確定了Amigo的1B染色體隨體區(qū)域,長穗偃麥草染色體片段約為120 Mb。利用多種TR-Oligo探針,將“川麥62”中5B-7B相互易位染色體的斷點分別定位于5B的99-151 Mb和7B的310-379 Mb之間。證實多探針ND-FISH可大幅度提高小麥及近緣物種染色體區(qū)段重排的鑒定分辨率,實現(xiàn)小麥外源新種質(zhì)的高效鑒定。綜上,本研究圍繞小麥及其近緣物種中的串聯(lián)重復(fù)序列,開展生物信息學(xué)分析,開發(fā)了可展示全基因組TR染色體分布的在線網(wǎng)絡(luò)服務(wù),已成為物種基因組TR分析的共享平臺。開發(fā)的新型基于TR的寡核苷酸探針,并構(gòu)建染色體物理定位整合圖譜,成功用于小麥外源染色體易位區(qū)段的精準(zhǔn)鑒定,實現(xiàn)了分子細胞遺傳學(xué)研究與基因組學(xué)新進展的緊密結(jié)合,研究結(jié)果對完善小麥基因組結(jié)構(gòu)、功能與進化的理論和指導(dǎo)小麥分子染色體工程育種的實踐都具有重要意義。
【學(xué)位授予單位】：電子科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S512.1
【圖文】：

B2DSC服務(wù)的主要流程

5 個次要頁面：已知探針頁（Known probes）、關(guān)于頁（About）、幫助頁（Help）、聯(lián)系頁（Contact us）和更新日志頁（Update log）（圖 2-3）。B2DSC 是一個可免費使用的網(wǎng)絡(luò)服務(wù)，可在 Chrome、Firefox 和 Edge 等現(xiàn)代瀏覽器中正常使用，在老版本的 Internet Explorer 等瀏覽器中則無法正常使用。

【參考文獻】

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本文編號：2718415