發(fā)布時間：2024-12-22 07:52

　　原核表達病毒病原dsRNA的抗病毒策略與植物抗病毒基因工程相比更加安全、便捷,且比體外合成dsRNA省時省力。百合受百合斑駁病毒(Lily mottle virus,LMoV)侵染嚴(yán)重,目前防治措施還是以傳統(tǒng)脫毒和化學(xué)處理為主,作為單子葉植物很難利用當(dāng)前轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到抗性百合。本研究首次利用原核表達系統(tǒng)得到了源于LMoV外殼蛋白(CP)和柱狀內(nèi)含體蛋白(CI)基因的dsRNA,并證明此方法在抗百合斑駁病毒上的可行性。本研究分別選取LMo V CP和CI的基因熱點序列,通過OZ-LIC(One-step,zero-background ligation-independent cloning)法將目的基因的正反片段分別插入到植物表達載體pRNAi-LIC內(nèi)含子的兩側(cè),成功構(gòu)建了含有CI-517 bp,CI-295 bp和CP-400 bp三種發(fā)卡結(jié)構(gòu)的RNAi載體。借助農(nóng)桿菌滲入法介導(dǎo)的瞬時表達系統(tǒng)在煙草上進行抗病毒分析,RT-PCR和間接ELISA結(jié)果顯示源于CI-517 bp和CI-295 bp的反向重復(fù)片段轉(zhuǎn)錄出的發(fā)卡RNA(hpRNA)對入侵病毒有較好的干擾作用,而CP-400 b...

【文章頁數(shù)】：67 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
引言
1 文獻綜述
    1.1 百合斑駁病毒(LMoV)研究進展
        1.1.1 LMoV概述
        1.1.2 LMoV的基因組學(xué)
        1.1.3 LMoV侵染對百合的生理病理影響
        1.1.4 LMoV的檢測
        1.1.5 LMoV的常規(guī)防治
    1.2 RNAi技術(shù)
        1.2.1 RNAi的發(fā)現(xiàn)
        1.2.2 RNAi的作用機制
    1.3 RNA沉默防治植物病毒的研究進展
        1.3.1 植物抗病毒基因工程的發(fā)展
        1.3.2 病毒對植物RNA沉默的抑制
    1.4 原核表達dsRNA進行植物抗病毒的研究進展
    1.5 本研究的目的、意義和內(nèi)容
2 ihpRNA干擾載體的構(gòu)建
    2.1 實驗材料和試劑
    2.2 實驗方法
        2.2.1 感病百合葉片總RNA的提取
        2.2.2 LMoV CI基因的獲得
        2.2.3 重組質(zhì)粒pMD^TM18-CI的獲得
        2.2.4 CI₅₁₇、CI₂₉₅、CP₄₀₀正反片段的獲得
        2.2.5 OZ-LIC法構(gòu)建ihpRNA干擾載體
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 重組質(zhì)粒pMD^TM18-CI的獲得
        2.3.2 CI₅₁₇、CI₂₉₅、CP₄₀₀正反片段的獲得
        2.3.3 ihpRNA干擾載體的獲得
    2.4 討論
    2.5 小結(jié)
3 瞬時表達檢測ihpRNA干擾載體的抗性
    3.1 實驗材料和試劑
    3.2 實驗方法
        3.2.1 農(nóng)桿菌工程菌的獲得
        3.2.2 農(nóng)桿菌滲入法介導(dǎo)的瞬時表達
        3.2.3 瞬時干擾作用的抗性檢測
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 農(nóng)桿菌工程菌的獲得
        3.3.2 瞬時干擾作用的抗性效果
    3.4 討論
    3.5 小結(jié)
4 原核表達LMoV編碼基因同源dsRNA的研究
    4.1 實驗材料和試劑
    4.2 實驗方法
        4.2.1 LMoV-dsRNA表達載體的構(gòu)建
        4.2.2 LMoV-dsRNA原核表達工程菌的構(gòu)建
        4.2.3 LMoV-dsRNA的誘導(dǎo)表達
        4.2.4 LMoV-dsRNA的鑒定
        4.2.5 LMoV-dsRNA的誘導(dǎo)條件優(yōu)化
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 LMoV-dsRNA表達載體的構(gòu)建
        4.3.2 LMoV-dsRNA原核表達工程菌的構(gòu)建
        4.3.3 LMoV-dsRNA的誘導(dǎo)表達
        4.3.4 LMoV-dsRNA的誘導(dǎo)條件優(yōu)化
    4.4 討論
    4.5 小結(jié)
5 LMoV-dsRNA的抗病性鑒定
    5.1 實驗材料和試劑
    5.2 實驗方法
        5.2.1 高壓破碎法制備dsRNA粗制品
        5.2.2 異丙醇沉淀法提取dsRNA
        5.2.3 dsRNA粗制品的穩(wěn)定性檢測
        5.2.4 dsRNA的抗病分析
    5.3 結(jié)果與分析
        5.3.1 LMoV-dsRNA的穩(wěn)定性檢測結(jié)果
        5.3.2 百合的發(fā)病情況
        5.3.3 RT-PCR檢測
        5.3.4 實時定量分析
    5.4 討論
    5.5 小結(jié)
6 結(jié)論與展望
    6.1 結(jié)論
    6.2 有待進一步開展的工作
參考文獻
附錄A 常用培養(yǎng)基、緩沖液及抗生素配方
附錄B 實驗所用儀器
附錄C 實驗所用質(zhì)粒圖譜及基因序列
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文情況
致謝



本文編號：4019686