發(fā)布時間：2024-12-03 20:20

　　柑橘黃龍病(Citrushuanglongbing,HLB)是世界范圍內(nèi)最具毀滅性的柑橘病害之一,給柑橘產(chǎn)業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失,實(shí)現(xiàn)其現(xiàn)場快速檢測具有重要意義。本課題以HLB最主要的病原菌Las(Candidatus Liberibacter asiaticus)為研究對象,著眼于其在現(xiàn)場檢測中存在的問題,以核酸擴(kuò)增技術(shù)為基礎(chǔ),對核酸提取、核酸擴(kuò)增、擴(kuò)增產(chǎn)物檢測這三個模塊的快速化、簡潔化地完成進(jìn)行研究,探索新型、簡便、快速的Las現(xiàn)場檢測方法。本論文的主要研究內(nèi)容及結(jié)論如下:(1)建立了 Las實(shí)時熒光PCR(Polymerase Chain Reaction)檢測方法。設(shè)計(jì)3組Las PCR引物并篩選出擴(kuò)增效果最優(yōu)的引物對,通過退火溫度的調(diào)節(jié)解決PCR的非特異性擴(kuò)增問題,最后評估了該體系的檢測靈敏度,其靈敏度與目前較常用的OI1/OI2cPCR方法相當(dāng)。綜上,所建立的Las實(shí)時熒光PCR檢測方法可代替OI1/OI2c PCR,用于Las的日常檢測。(2)建立了 基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(Loop Mediated Isothermal Amplification,LAMP)的Las現(xiàn)場可視化檢...

【文章頁數(shù)】：94 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
致謝
摘要
Abstract
符號清單
1 緒論
    1.1 柑橘黃龍病概況
        1.1.1 柑橘黃龍病的發(fā)生情況及分布
        1.1.2 柑橘黃龍病癥狀和危害
            1.1.2.1 柑橘黃龍病癥狀
            1.1.2.2 柑橘黃龍病危害
        1.1.3 柑橘黃龍病檢測技術(shù)
            1.1.3.1 傳統(tǒng)生物學(xué)診斷
            1.1.3.2 電鏡觀察
            1.1.3.3 血清學(xué)檢測
            1.1.3.4 分子生物學(xué)檢測
    1.2 基于核酸擴(kuò)增技術(shù)的檢測方法基本流程及其存在的問題
        1.2.1 核酸提取
        1.2.2 核酸擴(kuò)增
        1.2.3 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測
        1.2.4 本節(jié)小結(jié)
    1.3 核酸擴(kuò)增技術(shù)原理及在柑橘黃龍病檢測中的應(yīng)用
        1.3.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)原理及其在柑橘黃龍病檢測中的應(yīng)用
            1.3.1.1 PCR原理
            1.3.1.2 PCR在柑橘黃龍病檢測中的應(yīng)用現(xiàn)狀
        1.3.2 環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增(LAMP)原理及其在柑橘黃龍病檢測中的應(yīng)用
            1.3.2.1 LAMP原理
            1.3.2.3 LAMP在柑橘黃龍病檢測中的應(yīng)用現(xiàn)狀
        1.3.3 重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)原理及其在柑橘黃龍病檢測中的應(yīng)用
            1.3.3.1 RPA原理
            1.3.3.2 RPA在柑橘黃龍病檢測中的應(yīng)用現(xiàn)狀
        1.3.4 本節(jié)小結(jié)
    1.4 研究目的、內(nèi)容和技術(shù)路線
        1.4.1 研究目的和內(nèi)容
        1.4.2 技術(shù)路線
    1.5 本章小結(jié)
2 Las實(shí)時熒光PCR檢測方法的建立
    2.1 引言
    2.2 實(shí)驗(yàn)部分
        2.2.1 材料和試劑
            2.2.1.1 植物材料
            2.2.1.2 常用試劑
        2.2.2 儀器設(shè)備
        2.2.3 實(shí)驗(yàn)方法
            2.2.3.1 柑橘葉片核酸提取
            2.2.3.2 實(shí)時熒光PCR引物設(shè)計(jì)與體系建立
            2.2.3.3 OI1/OI2c PCR擴(kuò)增
            2.2.3.4 靈敏度評估
    2.3 結(jié)果與討論
        2.3.1 實(shí)時熒光PCR引物設(shè)計(jì)與體系建立
        2.3.2 靈敏度評估
    2.4 本章小結(jié)
3 基于LAMP的Las現(xiàn)場可視化檢測方法的建立
    3.1 引言
    3.2 實(shí)驗(yàn)部分
        3.2.1 材料和試劑
            3.2.1.1 植物材料
            3.2.1.2 常用試劑
        3.2.2 儀器設(shè)備
        3.2.3 實(shí)驗(yàn)方法
            3.2.3.1 柑橘葉片核酸快速提取
            3.2.3.2 LAMP引物設(shè)計(jì)和反應(yīng)體系建立
            3.2.3.3 TaqMan PCR
            3.2.3.4 LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物可視化檢測
            3.2.3.5 靈敏度評估
            3.2.3.6 實(shí)際樣本檢測
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 LAMP引物設(shè)計(jì)和體系建立
        3.3.2 柑橘葉片核酸快速提取
        3.3.3 LAMP產(chǎn)物可視化檢測
        3.3.4 基于LAMP的Las現(xiàn)場可視化檢測方法靈敏度評估
        3.3.5 實(shí)際樣本檢測
    3.4 本章小結(jié)
4 基于RPA的Las現(xiàn)場快速可視化檢測方法的建立
    4.1 引言
    4.2 實(shí)驗(yàn)部分
        4.2.1 材料和試劑
            4.2.1.1 植物材料
            4.2.1.2 常用試劑
        4.2.2 儀器設(shè)備
        4.2.3 實(shí)驗(yàn)方法
            4.2.3.1 NaOH法快速提取柑橘葉片DNA
            4.2.3.2 RPA引物設(shè)計(jì)及反應(yīng)體系建立
            4.2.3.3 實(shí)時熒光PCR
            4.2.3.4 RPA擴(kuò)增產(chǎn)物可視化檢測
            4.2.3.5 基于RPA的Las現(xiàn)場快速可視化檢測法靈敏度評估
            4.2.3.6 實(shí)際樣本檢測
    4.3 結(jié)果與討論
        4.3.1 RPA引物設(shè)計(jì)和反應(yīng)體系建立
        4.3.2 NaOH法快速提取柑橘葉片DNA
        4.3.3 RPA擴(kuò)增產(chǎn)物可視化檢測
        4.3.4 基于RPA的Las現(xiàn)場快速可視化檢測方法靈敏度評估
        4.3.5 實(shí)際樣本檢測
    4.4 本章小結(jié)
第五章 總結(jié)與展望
    5.1 主要研究結(jié)論
    5.2 主要特色及創(chuàng)新點(diǎn)
    5.3 進(jìn)一步研究展望
參考文獻(xiàn)
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本文編號：4014084