發(fā)布時(shí)間：2020-07-24 10:52

【摘要】： 奧奈達(dá)希瓦氏菌(Shewanella onedensis:S.onedensis)具有代謝方式的多樣性和靈活性,是生物修復(fù)與生物進(jìn)化領(lǐng)域研究的模式菌株。因?yàn)橄Ｍ呤暇鷮?duì)不溶性金屬的還原性,以及在生物燃料電池等方面潛在的應(yīng)用前景,使得希瓦氏菌生物膜的研究成為近年來(lái)該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。已報(bào)道的文獻(xiàn)對(duì)該菌在固體表面形成生物膜的研究較多,但在氣液界面形成生物膜的研究未見(jiàn)報(bào)道。 本論文首次構(gòu)建了Shewanella onedensis MR-1靜置培養(yǎng)條件下形成氣液界面生物膜的生長(zhǎng)體系,結(jié)合微生物生理學(xué)、生物化學(xué)與分子生物學(xué)的研究方法對(duì)氣液界面生物膜形成的條件、必需因素和分子機(jī)制進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究。主要取得了以下結(jié)論和認(rèn)識(shí): (1)構(gòu)建MR-1氣液界面生物膜生長(zhǎng)的培養(yǎng)體系,探討該生物膜生長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)和生長(zhǎng)特征。 研究了靜置培養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)氣液界面生物膜的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)和培養(yǎng)體系的氧氣條件等生長(zhǎng)特征。實(shí)驗(yàn)表明氣液界面生物膜僅在好氧條件下形成,且形成生物膜時(shí)浮游細(xì)胞的臨界濃度(OD_(600))為0.23,浮游細(xì)胞濃度(OD_(600))超過(guò)0.23后,細(xì)胞開(kāi)始粘附到氣—固—液界面,然后擴(kuò)展到氣-液交界面成膜。在厭氧靜置培養(yǎng)時(shí),即使浮游細(xì)胞密度(OD_(600))達(dá)到0.4,液體表面也沒(méi)有觀察到生物膜的形成,說(shuō)明氧氣條件和一定濃度的浮游細(xì)胞是氣液界面生物膜形成的重要條件。 (2)研究胞外基質(zhì)的主要成分,觀察生物膜的微觀形貌特點(diǎn)。 胞外基質(zhì)是生物膜的重要組成部分,一般包括蛋白質(zhì)、纖維素和DNA等組分。本文實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),大于100μg/mL的蛋白酶K不僅能阻止生物膜的形成,而且可以破壞生長(zhǎng)成熟的生物膜。而DNaseⅠ(0-1000U/mL)和纖維素酶(0-100U/mL)對(duì)生物膜的形成沒(méi)有影響,也不能破壞成熟的生物膜。說(shuō)明而纖維素和DNA不是生物膜基質(zhì)中的主要成分,蛋白質(zhì)對(duì)生物膜形成與穩(wěn)定有重要作用。所以,淪文對(duì)蛋白分泌系統(tǒng)及其分泌的蛋白進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。SEM分析顯示成熟的MR-1氣液界面生物膜是由多層密集細(xì)胞組成,膜上細(xì)胞從頂端產(chǎn)生直徑約10nm,幾到幾十微米長(zhǎng)的納米線。 (3)應(yīng)用MR-1全基因組cDNA芯片,揭示同一培養(yǎng)體系中氣液界面生物膜與浮游細(xì)胞表達(dá)的各種差異。 為了研究氣液界面生物膜與浮游細(xì)胞的差異和生物膜形成的機(jī)理,文章利用MR-1全基因組cDNA芯片研究了同一培養(yǎng)系統(tǒng)中氣液界面生物膜與浮游細(xì)胞表達(dá)的差異。芯片分析結(jié)果表明:1)浮游細(xì)胞與氣液界面生物膜細(xì)胞表達(dá)差異的基因涉及MR-1生理代謝的各個(gè)方面,占總編碼序列的19.0%;2)在生物膜細(xì)胞中,所有三羧酸循環(huán)基因和ATP合成酶基因都上調(diào),13個(gè)編碼NADH脫氫酶的基因有12個(gè)上調(diào);與厭氧呼吸有關(guān)的基因在浮游細(xì)胞中表達(dá)上調(diào);說(shuō)明氣液界面生物膜細(xì)胞是以有氧呼吸為主,浮游細(xì)胞以厭氧呼吸為主;(3)蛋白運(yùn)輸基因在兩種細(xì)胞中表達(dá)差異顯著,特別是鐵與血紅素吸收與運(yùn)輸?shù)幕�因在生物膜中一致上調(diào),采用q-RT-PCR驗(yàn)證了芯片雜交實(shí)驗(yàn)的可靠性,說(shuō)明鐵在生物膜的形成過(guò)程中有某種程度的作用。 (4)系統(tǒng)研究了EDTA和Fe、Ca、Mn、Cu、Zn、Mg等金屬離子分別對(duì)MR-1氣液界面生物膜形成的影響 首先,構(gòu)建了△hmuT和△hugA兩株鐵運(yùn)輸基因突變株,發(fā)現(xiàn)突變株與野生株形成氣液界面生物膜的能力一樣;說(shuō)明鐵對(duì)MR-1生物膜形成貢獻(xiàn)較小,cDNA芯片識(shí)別的鐵運(yùn)輸基因不是與生物膜的形成功能特異性相關(guān),它們的表達(dá)差異是對(duì)氣液界面生物膜生成環(huán)境的適應(yīng)性響應(yīng)。 其次,研究了EDTA和其它金屬離子對(duì)氣液界面生物膜形成的作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):0.3mM EDTA完全抑制了生物膜的生成;大于0.3mM Ca(Ⅱ)、Mn(Ⅱ)、Cu(Ⅱ)和Zn(Ⅱ)能完全消除EDTA對(duì)生物膜形成的抑制;而Mg(Ⅱ)加入含EDTA的培養(yǎng)液不能恢復(fù)生物膜的形成;說(shuō)明前四種金屬離子在生物膜形成中有重要的促進(jìn)作用。0.3mM Fe(Ⅱ)或Fe(Ⅲ)加入含EDTA的培養(yǎng)液,MR-1生物膜形成量?jī)H為沒(méi)有EDTA處理的42.5%和40.8%,進(jìn)一步驗(yàn)證了鐵對(duì)MR-1生物膜形成貢獻(xiàn)較小。 (5)探討與生物膜形成相關(guān)的蛋白及其分泌通道 首先,采用RT-PCR對(duì)MR-1基因組中依次排列的rtxB、emrA、aggA和ompA基因轉(zhuǎn)錄關(guān)系進(jìn)行分析,結(jié)果表明它們同屬于rtxB操縱子。利用生物信息學(xué)的方法對(duì)rtxB操縱子的可能啟動(dòng)子序列進(jìn)行了預(yù)測(cè)和分析。其次采用基因同源重組方法構(gòu)建了Ⅰ型蛋白分泌系統(tǒng)三個(gè)基因的突變株△rtB,△emrA和△aggA,分泌系統(tǒng)上游基因突變株△rtx,下游基因突變株△ompA。 實(shí)驗(yàn)表明:△rtx,△rtxB,△emrA和△aggA四株突變株都喪失了在氣液界面形成生物膜的能力,它們?cè)诠腆w表面生成生物膜的速率比野生株慢,說(shuō)明Ⅰ型蛋白分泌系統(tǒng)及其上游Rtx毒素蛋白與氣液界面生物膜形成相互關(guān)聯(lián)。在生物膜形成、上清液互補(bǔ)、群集運(yùn)動(dòng)、SEM等分析中△rtx突變株與Ⅰ型蛋白分泌系統(tǒng)突變株表型高度一致,說(shuō)明Rtx毒素蛋白通過(guò)Ⅰ型蛋白分泌系統(tǒng)分泌至胞外,促使生物膜的形成。 最后,建立了Rtx毒素蛋白通過(guò)Ⅰ型分泌系統(tǒng)分泌到膜外,與Ca~(2+)結(jié)合導(dǎo)致細(xì)胞間的連接和成膜的模型。 (6)研究c型細(xì)胞色素對(duì)氣液界面生物膜形成的影響和機(jī)制 c型細(xì)胞色素是電子傳遞鏈上重要組分,對(duì)其研究主要集中在厭氧呼吸系統(tǒng),研究其對(duì)氣液界面生物膜的影響有助于探明生物膜的形成機(jī)理。研究了12株c型細(xì)胞色素突變株對(duì)氣液界面生物膜形成的影響。首次研究并發(fā)現(xiàn)△SO4666完全喪失了成膜能力;△SO1777,△SO1782,△S02361和△SO2363成能力下降。研究了12株c型細(xì)胞色素突變株在生物膜細(xì)胞和浮游細(xì)胞中的競(jìng)爭(zhēng)生長(zhǎng)。生物膜細(xì)胞或浮游細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)生長(zhǎng)后,△SO1777,△SO1782,△SO2361和△SO2363四株菌的細(xì)胞數(shù)量都減少,說(shuō)明它們通過(guò)影響靜置生長(zhǎng)時(shí)浮游細(xì)胞的生長(zhǎng)速度影響生物膜的形成。掃描電鏡觀察喪失成膜能力的△SO4666突變株表面結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表面納米線缺失;△SO4666變株群集運(yùn)動(dòng)能力比野生株弱;說(shuō)明△SO4666突變株由于納米線的缺失,導(dǎo)致群集運(yùn)動(dòng)能力降低以及氣液界面生物膜形成能力的喪失,納米線是MR-1菌株氣液界面生物膜形成必需的元素。
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類(lèi)號(hào)】：X703
【圖文】：

科技工作者利用不同的方法研究了金屬離子在生物膜中的存在形式和作用機(jī)理，試圖運(yùn)用各種化學(xué)的、生物的理論，從細(xì)胞和分子層面來(lái)解釋生物膜與金屬的相互作用〔’7〕(圖1一3)。金屬離子與細(xì)胞或其分泌物質(zhì)結(jié)合，在生物膜中的存在方式主要有以下幾類(lèi):(l)生物膜胞外基質(zhì)。多糖、蛋白質(zhì)、 DNA以及它們的單體作為細(xì)菌生物膜胞外聚合基質(zhì)的主要組分，它們通過(guò)帶負(fù)電核的輕基，梭基，琉基等，和金屬元素通過(guò)相反電荷間的靜電相互作用、甚至是成鍵作用緊密結(jié)合，穩(wěn)定生物膜的結(jié)構(gòu)〔川。(2)細(xì)菌表面結(jié)構(gòu)。細(xì)胞膜與細(xì)胞壁能提供許多離子結(jié)合位點(diǎn)與金屬離子結(jié)合，例如細(xì)胞壁上脂肪酸糖脂「以2:l]。(3)細(xì)菌代謝終產(chǎn)物。微生物的很多代謝終產(chǎn)物可以與金屬離子反應(yīng)，產(chǎn)生金屬沉淀復(fù)合物，如硫化物或碳酸鹽;散布在活細(xì)胞間的死亡細(xì)胞是生物膜中容易被忽視的組份〔‘了〕，它具有化學(xué)反應(yīng)活性，能夠提供沉淀或絡(luò)合金屬的位點(diǎn);另外

C偽栩扭咖助容爪mSu揚(yáng)蕊側(cè)叨的圖1一2成熟細(xì)菌生物膜的結(jié)構(gòu)Fig.l一 2Maturebiofilmstructureeontaininglayers， ineludingbulkofbiofilm，linkingfilm， eonditioningfilm， andthesubstratumtowhiehthefilm15attached. 1.2.2金屬離子對(duì)生物膜形成的作用機(jī)理近年來(lái)，科技工作者利用不同的方法研究了金屬離子在生物膜中的存在形式和作用機(jī)理，試圖運(yùn)用各種化學(xué)的、生物的理論，從細(xì)胞和分子層面來(lái)解釋生物膜與金屬的相互作用〔’7〕(圖1一3)。金屬離子與細(xì)胞或其分泌物質(zhì)結(jié)合，在生物膜中的存在方式主要有以下幾類(lèi):(l)生物膜胞外基質(zhì)。多糖、蛋白質(zhì)、 DNA以及它們的單體作為細(xì)菌生物膜胞外聚合基質(zhì)的主要組分

革蘭氏陽(yáng)性菌通常通過(guò)專(zhuān)一的ABC(ATPbindingCaSSette)蛋白分泌膚信號(hào)分子，膚信號(hào)分子被同源雙組分轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)的感應(yīng)激酶蛋白分子識(shí)別，與胞漿反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白相互作用，產(chǎn)生磷酸化與去磷酸化的系列反應(yīng)而誘導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)。葡萄球菌群體感應(yīng)系統(tǒng)中的輔助基因調(diào)節(jié)因子能被膚信號(hào)分子激活，調(diào)控?cái)?shù)種細(xì)菌蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)多種毒力因子的分泌，影響生物被膜生長(zhǎng)和發(fā)展[45〕LuxS依賴(lài)的群體感應(yīng)信號(hào)在細(xì)菌生物被膜形成過(guò)程中起重要的作用。在鏈球菌突變體研究中發(fā)現(xiàn)了以又交變株形成的生物膜結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，質(zhì)地粗糙，基質(zhì)間間隙增大，呈現(xiàn)顆粒狀外觀〔側(cè)。細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)，使作為單細(xì)胞生物的細(xì)菌具備了部分類(lèi)似多細(xì)胞生物的功能，讓細(xì)菌在應(yīng)對(duì)環(huán)境挑戰(zhàn)時(shí)，能協(xié)調(diào)一致，以群體的力量共同完成一些單個(gè)或浮游狀細(xì)菌無(wú)法完成的功能。影響生物膜結(jié)構(gòu)的因素很多，包括水力學(xué)條件、胞外多聚物的數(shù)量，細(xì)菌的移動(dòng)性以及金屬離子的種類(lèi)和濃度等等，細(xì)菌群

【引證文獻(xiàn)】

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