發(fā)布時(shí)間：2018-01-09 02:30

  本文關(guān)鍵詞：家蠶與白僵菌互作機(jī)制的研究　出處：《江蘇科技大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：家蠶(Bombyx mori)是鱗翅目昆蟲的代表物種,是人類經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期馴化而得來(lái)的重要經(jīng)濟(jì)昆蟲之一,有著良好的科學(xué)研究基礎(chǔ),是探索昆蟲免疫防御機(jī)制、病原互作機(jī)制的重要模式生物。球孢白僵菌(Beauveria bassiana)是研究和應(yīng)用最多的病原真菌之一,能夠引起家蠶等經(jīng)濟(jì)昆蟲白僵病的發(fā)生,給蠶桑產(chǎn)業(yè)等經(jīng)濟(jì)昆蟲產(chǎn)業(yè)帶來(lái)了重大的經(jīng)濟(jì)損失。與此同時(shí),球孢白僵菌因其寄主范圍廣泛、致病性較強(qiáng)、適應(yīng)性較強(qiáng)、兼容性較強(qiáng)以及制備和應(yīng)用操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn),被認(rèn)為是最好的生物防治菌種,廣泛應(yīng)用于農(nóng)林產(chǎn)業(yè)害蟲的防治過(guò)程。本研究以球孢白僵菌為病原,以家蠶為宿主昆蟲,分別從病原侵染機(jī)制、病原致病機(jī)制和昆蟲防御機(jī)制等三個(gè)方面闡釋了白僵菌與家蠶的互作機(jī)制,取得如下主要結(jié)果。一、球孢白僵菌對(duì)家蠶的侵染機(jī)制體壁感染是球孢白僵菌侵入寄主昆蟲的主要方式,胞外水解酶在體壁感染中起到重要作用。本文檢測(cè)了11株白僵菌對(duì)家蠶的侵染毒力、胞外蛋白酶和胞外幾丁質(zhì)酶酶活力及相關(guān)基因的表達(dá)水平,并通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析軟件分析了胞外蛋白酶和幾丁質(zhì)酶活性與白僵菌對(duì)家蠶侵染毒力的關(guān)系;檢測(cè)了蛋白酶和幾丁質(zhì)酶抑制劑對(duì)侵染毒力的影響;應(yīng)用酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了白僵菌昆蟲體壁降解蛋白酶(BbCDEP1)并測(cè)定了該酶對(duì)家蠶體壁的降解作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,不同菌株的孢外蛋白酶活力和Bbcdep1的表達(dá)水平與半數(shù)發(fā)病時(shí)間(MMT)和半數(shù)致死時(shí)間(LT50)均呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系,擬合方程符合阻滯生長(zhǎng)方程(Logistic equation)模型,而蛋白酶抑制劑實(shí)驗(yàn)也證明白僵菌胞外蛋白酶抑制之后明顯降低了侵染毒力;蠶皮凍干粉誘導(dǎo)之后,不同菌株的Bbcdep1表達(dá)水平顯著提高,但上調(diào)倍數(shù)差異顯著;蠶體實(shí)驗(yàn)表明,白僵菌侵染家蠶之后,Bbcdep1僅在侵染前期上調(diào)表達(dá),與孢子萌發(fā)時(shí)間相符合;酵母系統(tǒng)表達(dá)的BbCDEP1蛋白能高效降解家蠶體壁組織,其降解能力相當(dāng)于50%的蛋白酶K的活性。另外,統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明,白僵菌菌株之間幾丁質(zhì)酶活力的差異不顯著,而且胞外幾丁質(zhì)酶活性與毒力的統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性也不顯著;但是用抑制劑抑制幾丁質(zhì)酶活性后,白僵菌的毒力明顯下降;定量PCR結(jié)果表明兩種白僵菌幾丁質(zhì)酶基因(Bbchit 1和Bbchit2)在蠶皮粉誘導(dǎo)下上調(diào)表達(dá)模式不同,Bbchit 1在各菌株均上調(diào)表達(dá),而Bbchit 2僅在部分菌株中上調(diào)表達(dá),但是在白僵菌侵染家蠶過(guò)程中,Bbchit 1和Bbchit 2在孢子萌發(fā)和體壁穿透過(guò)程中均上調(diào)表達(dá),而且Bbchit 2在白僵菌感染家蠶后期顯著上調(diào)表達(dá),說(shuō)明Bbchit 2可能參與了后期的致死過(guò)程。以上結(jié)果說(shuō)明,白僵菌胞外蛋白酶和幾丁質(zhì)酶是白僵菌侵染家蠶的重要毒力因子,但是它們的表達(dá)模式差異顯著;bbcdep1可以作為毒力改造的目標(biāo)基因,而bbcdep1也可以用于生物蛋白酶制劑的開發(fā)和利用;白僵菌胞外幾丁質(zhì)酶不僅參與侵染過(guò)程,還參與后期的致病過(guò)程,其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。二、球孢白僵菌對(duì)家蠶的致病機(jī)制病原真菌通過(guò)營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)、分泌真菌毒素和破壞氧化還原平衡而最終導(dǎo)致宿主昆蟲死亡。我們提取了白僵菌毒素并檢測(cè)了毒素對(duì)家蠶幼蟲的存活率和bmn細(xì)胞的影響;用實(shí)時(shí)定量pcr的方法檢測(cè)了白僵菌侵染家蠶之后家蠶糖代謝酶系和抗氧化酶系相關(guān)基因表達(dá)量的變化;此外,我們還檢測(cè)了白僵菌侵染家蠶之后總抗氧化能力、sod、和cat活性的變化以及添加外源抗氧化劑對(duì)白僵菌毒力的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,白僵菌毒素能夠顯著降低家蠶幼蟲的存活時(shí)間,而且能夠使家蠶細(xì)胞發(fā)生凝集作用并最終崩解死亡。白僵菌侵染家蠶之后,糖代謝酶系相關(guān)基因顯著下調(diào)表達(dá),說(shuō)明白僵菌能夠影響家蠶糖代謝水平,破壞家蠶能量代謝。此外,白僵菌侵染家蠶之后,總抗氧化活力、sod和cat酶活性顯著下降,抗氧化酶系相關(guān)基因表達(dá)水平在感染后期顯著降低,而添加外源sod和cat等抗氧化劑能顯著提高家蠶的存活時(shí)間,說(shuō)明白僵菌侵染家蠶后會(huì)破壞家蠶體內(nèi)的抗氧化平衡。以上結(jié)果說(shuō)明,白僵菌通過(guò)分泌毒素、破壞家蠶的能量代謝和抗氧化平衡最終導(dǎo)致家蠶死亡,但具體的作用機(jī)制還要進(jìn)一步探索。三、家蠶對(duì)白僵菌感染的免疫防御機(jī)制昆蟲的先天性免疫防御體系是抵抗病原微生物入侵的重要屏障。不同的病原會(huì)激活不同的免疫信號(hào)通路和免疫效應(yīng)因子而引起不同的免疫反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)實(shí)時(shí)定量的方法檢測(cè)了家蠶感染白僵菌后toll信號(hào)通路、imd信號(hào)通路、jak/stat信號(hào)通路和黑化作用相關(guān)基因,以及抗菌肽(amps)等效應(yīng)因子的表達(dá)水平;通過(guò)rnai的方法分析了toll信號(hào)通路和jak/stat信號(hào)通路的信號(hào)傳遞機(jī)制;檢測(cè)了信號(hào)通路特異的抑制劑抑制信號(hào)傳遞后對(duì)家蠶幼蟲存活率和血淋巴抗真菌活性的影響;用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了家蠶抗菌肽,并測(cè)定了其對(duì)白僵菌的抗菌活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,白僵菌侵染家蠶之后,能夠激活toll信號(hào)通路、imd信號(hào)通路、jak/stat信號(hào)通路和黑化作用,導(dǎo)致相關(guān)信號(hào)因子表達(dá)水平的改變,但是各信號(hào)因子在白僵菌感染家蠶的不同時(shí)期表達(dá)水平差異顯著。bmβgrprnai干擾實(shí)驗(yàn)表明,家蠶中可能存在兩條toll信號(hào)子通路:bmβgrp1-bmtoll3 bmtoll6 bmtoll9-bmspaetzle bmgloverin2和bmβgrp2orbmβgrp3 bmtoll7-bmlysozyme,它們?cè)诳拱捉┚�侵染過(guò)程中可能起到重要作用。家蠶感染白僵菌后,bmpgrp-lc、bmdredd、bmfadd、bmtak1和bmrelish1在不同的感染時(shí)期顯著上調(diào)表達(dá),而bmrelish2卻顯著下調(diào)表達(dá),說(shuō)明白僵菌入侵能夠激活家蠶的imd信號(hào)通路,但可能主要通過(guò)bmrelish1調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)。家蠶感染白僵菌后,bmctl5、bmhop、bmstat均顯著上調(diào)表達(dá),已知的jak/stat信號(hào)通路負(fù)調(diào)控因子bmsocs2、bmsocs6和bmken則顯著下調(diào)表達(dá),而另一個(gè)調(diào)節(jié)基因——bmdrk則顯著上調(diào)表達(dá),說(shuō)明白僵菌侵染家蠶也能激活jak/stat信號(hào)通路;不同病原感染實(shí)驗(yàn)也表明,jak/stat信號(hào)通路只能被白僵菌所激活,而不能被lps和bmcpv激活;此外,bmctl5rnai干擾實(shí)驗(yàn)證明bmctl5可能是jak/stat信號(hào)通路的重要模式識(shí)別受體。家蠶感染白僵菌后,10種bmserpin表達(dá)模式差異顯著,bmserpin1、bmserpin5、bmserpin7、bmserpin8和bmserpin10在白僵菌感染的不同時(shí)期下調(diào)表達(dá),預(yù)示它們可能參與到絲氨酸級(jí)聯(lián)反應(yīng)的調(diào)控,激活黑化作用等免疫反應(yīng);bmserpin2、bmserpin3、bmserpin4、bmserpin6和bmserpin9在整個(gè)感染過(guò)程中上調(diào)表達(dá),我們推測(cè)它們可能通過(guò)抑制白僵菌絲氨酸蛋白酶——bbcdep的活性,來(lái)提高家蠶的抗真菌活力。另外,酚氧化酶活化級(jí)聯(lián)反相關(guān)基因在白僵菌侵染家蠶的整個(gè)過(guò)程中都顯著上調(diào)表達(dá),說(shuō)明白僵菌侵染家蠶會(huì)引發(fā)家蠶強(qiáng)烈的黑化反應(yīng),也進(jìn)一步說(shuō)明了黑化作用在昆蟲抗真菌免疫中起到重要作用�？咕�肽是昆蟲先天性免疫反應(yīng)的直接效應(yīng)因子。家蠶感染家蠶感染白僵菌后bmmoricin1、bmdefencin、bmgloverin2、bmlysozyme、bmcecropina、bmcecropinb、bmattacin、bmlebocin1均顯著上調(diào)表達(dá),而抑菌活性實(shí)驗(yàn)表明,只有bmcecropina、bmcecropinb和bmattacin三種抗菌肽對(duì)白僵菌有明顯的抑制作用,推測(cè)其它抗菌肽的上調(diào)表達(dá)可能是由于白僵菌主動(dòng)調(diào)控家蠶抗菌肽的表達(dá),以抑制其它雜菌的生長(zhǎng),以保護(hù)自己的營(yíng)養(yǎng)和寄生需求。為進(jìn)一步分析家蠶幼蟲解毒和抗氧化防御系統(tǒng)在球孢白僵菌侵染過(guò)程中的作用,我們檢測(cè)了家蠶幼蟲感染球孢白僵菌以及注射球孢白僵菌毒素之后血淋巴、中腸和脂肪體中g(shù)sts酶活力、gsh-px酶活力、gr酶活力、gsh含量及其基因表達(dá)水平的變化,同時(shí)還檢測(cè)了注射gsh和毒素對(duì)家蠶幼蟲感染球孢白僵菌后存活率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,家蠶感染白僵菌后脂肪體、中腸、血淋巴中的gsts、gr、gsh-px酶活力顯著提高,各組織中bmgstd1、bmgsts1、bmgsto1和bmgsh-px的表達(dá)量在感染后期也顯著上調(diào)表達(dá),而gsh含量卻急劇下降,說(shuō)明家蠶幼蟲可以通過(guò)增加酶活力并上調(diào)解毒和抗氧化因子的表達(dá)量以增強(qiáng)抗真菌感染能力。毒素注射實(shí)驗(yàn)表明家蠶幼蟲對(duì)球孢白僵菌毒素的解毒作用主要在脂肪體和血淋巴中依賴gsts、gr和gsh來(lái)完成,同時(shí)定量實(shí)驗(yàn)表明bmgsts1和bmgsto1在注射毒素24h后顯著上調(diào)表達(dá),說(shuō)明它們可能是家蠶幼蟲對(duì)球孢白僵菌毒素的主要解毒基因。存活率實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明gsh能夠緩解球孢白僵菌毒素對(duì)蠶體的損害,延長(zhǎng)家蠶幼蟲的半數(shù)致死時(shí)間(約6h)。以上結(jié)果說(shuō)明,家蠶幼蟲GSTs和GSH-Px構(gòu)成的解毒和抗氧化防御系統(tǒng)在抗真菌感染過(guò)程中起到重要作用。本文取得的研究成果,為家蠶抗性品種的培育、新型抗真菌藥物和新型生防制劑的研發(fā)提供了重要的科學(xué)依據(jù)。
[Abstract]:In this paper , the relationship between the activity of extracellular protease and chitinase and its relative gene expression was studied by means of statistical analysis software . The expression of Bbchit 1 and Bbchit 2 in silkworm larvae was raised up - regulated . The results showed that Bbchit 2 could significantly decrease the survival time of silkworm larvae and the effect of exogenous antioxidants on the virulence of Bombyx mori . 媯，

本文編號(hào)：1399674