本文關鍵詞：大鼠肝郁脾虛證的代謝組學研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

；中西醫(yī)結合學報２００７年５月第５卷第３期Jour；·３０７·；大鼠肝郁脾虛證的代謝組學研究；羅和古，丁杰，岳廣欣，陳家旭；北京中醫(yī)藥大學中醫(yī)診斷系，北京１０００２９；目的：研究慢性束縛應激大鼠（肝郁脾虛模型）的血漿；方法：選用實驗用二級雄性SD大鼠２４只，隨機分為；NMR）波譜儀檢測；０．０４ppm，進行分段積

中西醫(yī)結合學報２００７年５月第５卷第３期　JournalofChineseIntegrativeMedicine，May２００７；Vol．５，No．３

·３０７·

大鼠肝郁脾虛證的代謝組學研究

羅和古，丁杰，岳廣欣，陳家旭

北京中醫(yī)藥大學中醫(yī)診斷系，北京１０００２９

目的：研究慢性束縛應激大鼠（肝郁脾虛模型）的血漿代謝表型改變，開展中醫(yī)證候學的研究，試圖通過對慢性束縛應激大鼠代謝物組的共性分析和生物標記物的發(fā)現(xiàn)，尋找肝郁脾虛證候的生物學本質，探討代謝組學在中醫(yī)證候學研究中的應用。

方法：選用實驗用二級雄性SD大鼠２４只，隨機分為４組：７d正常對照組（A組）、２１d正常對照組（B組）、７d模型組（C組）和２１d模型組（D組），每組６只。以慢性束縛方法制作應激大鼠模型。分別于第８天和第２２天麻醉后心室取血，用VarianUnityInova６００M超導傅立葉變化核磁共振（nuclearmagneticresonance，程序將H譜按默認值，分別從４．５～０．５ppm（弛豫時間編輯）以及６．０～０ppm（擴散編輯），每段為

１

NMR）波譜儀檢測。自由感應衰減信號經(jīng)過３２k傅立葉變換轉為一維NMR譜圖。調用VNMR軟件中的

０．０４ppm，進行分段積分，將積分數(shù)據(jù)歸一化后，以文本文件或Excel文件貯存，用于模式識別分析。將上述得到的數(shù)據(jù)文件利用SimcaP１０．０軟件包進行主成分分析。

結果：大鼠血漿１HNMR譜的主成分分析，各組動物代謝譜各不相同，與已知應激狀態(tài)下動物體內代謝的調未知化合物的譜峰峰形改變較為明顯。這些發(fā)生改變的代謝物可以作為肝郁脾虛證的生物標志物做進一步的研究。

物，闡釋中醫(yī)證候的生物學本質。代謝組學分析是一種有良好發(fā)展前景的中醫(yī)證候學研究方法。關鍵詞：代謝組學；模式識別；核磁共振；中醫(yī)；大鼠

中圖分類號：R２５；文獻標識碼：A；文章編號：１６７２１９７７（２００７）０３０３０７０７

結論：各組大鼠血漿HNMR代謝譜之間存在差異，而且可能從代謝組學分析中找出特異的標志性代謝產(chǎn)

１

節(jié)過程及結果相一致。正常對照組與模型組相比較發(fā)現(xiàn)，醋酸、乳酸、酪氨酸、低密度脂蛋白和３．４４ppm的

Metabonomicstudyofsyndromeofliverqistagnationandspleendeficiencyinrats

HeguLUO，JieDING，GuangxinYUE，JiaxuCHEN

DepartmentofDiagnosticsofTraditionalChineseMedicine，BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing１０００２９，China

Objective：Todeterminethechangesoftheplasmametabolicphenotypeinratswithchronicrestraintstress（ratswithsyndromeofliverqistagnationandspleendeficiency），soastorevealthebiologicalfeaturesofthesyndromeofliverqistagnationandspleendeficiency，andtoexaminepotentialapplicationofmetabonomicanalysisinstudiesofsyndromesintraditionalChinesemedicine．

Methods：TwentyfourmaleSpragueDawleyratswererandomlydividedintofourgroups：groupA，７dnormalcontrolgroup；groupB，２１dnormalcontrolgroup；groupC，７dstressgroup；andgroupD，２１dstressgroup，with６ratsineachgroup．Chronicrestraintwasusedtoinducestressinrats．Bloodwascollectedfromthecardioventricleunderanesthesiaonthe８th（groupsAandC）or２２ndday（groupsBandD）anddetectedbyusingtheFouriervariablesuperconductingnuclearmagneticresonance（NMR）spectrometer（VarianUnityInova６００M）．FreeinductiondecaysignalsweretransferredintoonedimensionalNMRspectrogramvia３２kFouriertransformation．Segmentalintegralcalculus（０．０４ppmpersegment）wasperformedfrom４．５０．５ppm（CarrPurcellMeiboomGill，CPMG）or６．００ppm（longitudinaleddydelay，LED）asdefaulted１

HspectravaluesbyusingtheVNMRsoftware．Dataweresavedastextorexcelfilesafternormalizationandthenusedforpatternrecognitionanalyses．Allthedatawereanalyzedbyprincipalcomponentanalysis（PCA）usingtheSIMCAP１０．０software（UmetricsAB，Umea，Sweden）．

基金項目：國家自然科學基金資助項目（No．３０６７２５７８）

Correspondence：JiaxuCHEN，MD，Professor；Tel：０１０６４２８７０７４；Email：chenjiaxu＠hotmail

．com

轉載

中國科技論文在線

·３０８·

中西醫(yī)結合學報２００７年５月第５卷第３期　JournalofChineseIntegrativeMedicine，May２００７；Vol．５，No．３

１

Results：ThePCAanalysisofratplasmaHNMRspectrarevealeddifferentmetabolicspectrabetweenstress

andcontrolgroups，whichwereconsistentwithalterationsofinvivometabolismsinratsunderstressstimuli．Comparedwiththenormalcontrolgroup，ratswithrepeatedstressdisplayedsignificantchangesinspectralpeakshapesofacetate，lactate，tyrosine，lowdensitylipoprotein，andunknowncompounds（３．４４ppm）．Thesealteredmetabolitescanbeusedasbiomarkersofsyndromeofliverqistagnationandspleendeficiencyforfurtherstudies．

１

Conclusion：TheHNMRspectraofmetabolitesintheratbloodaredifferentiallychangedafterchronicstress．Specific，characteristicmetabolicproductscanbeidentifiedbyanalysesofmetabonomics，whichleadtointerpretationofbiologicalfeatureofChinesemedicinesyndromes．Therefore，metabonomicanalysisisanapproachwithgooddevelopmentprospectstostudiesofTCMsyndromes．

Keywords：metabonomics；patternrecognition；nuclearmagneticresonance；traditionalChinesemedicine；rats

LuoHG，DingJ，YueGX，ChenJX．JChinIntegrMed／ZhongXiYiJieHeXueBao．２００７；５（３）：３０７３１３．ReceivedDecember６，２００６；publishedonlineMay１５，２００７．Freefulltext（PDF）isavailableatwww．jcimjournal．com

　　代謝組學是繼基因組學、轉錄組學和蛋白質組學之后新近發(fā)展起來的一門學科，是系統(tǒng)生物學的重要組成部分。它主要研究生物對外源性物質所引起的病理生理反應，以及對遺傳變異的應答和內源性代謝物的動態(tài)變化，通過對生物體液和組織中隨時間改變的代謝物進行檢測、確定、定量和分類，將這些代謝信息與病理生理過程中的生物學事件關聯(lián)起來，以監(jiān)測活細胞中的化學變化。

本課題組用慢性束縛應激大鼠模型，以動物行為學評定和以方測證等方法確定該模型為肝郁脾虛證候模型，運用代謝組學技術開展中醫(yī)證候學的研究，試圖通過對中醫(yī)病證引起的代謝物的共性分析和生物標記物的發(fā)現(xiàn)，尋找中醫(yī)證候的生物學本質，促進中醫(yī)辨證的科學化和定量化，將代謝組學技術和中醫(yī)藥學的研究結合起來，探索出中醫(yī)藥復雜理論體系研究的新方法與新途徑。1　材料與方法

１．１　動物與分組　實驗用二級雄性SD大鼠２４只，體質量（２００±２０）g，購自北京維通利華實驗動物研究中心，合格證號為SCXK京２００２０００３。適應性飼養(yǎng)３d后隨機分為：７d正常對照組（A組）、２１d正常對照組（B組）、７d模型組（C組）和２１d模型組（D組）４組，每組各６只。動物每籠６只群養(yǎng)，飼養(yǎng)于普通級動物房，室內溫度保持為（２２±２）℃，相對濕度保持為３０％～４０％，各組大鼠喂常規(guī)飼料，自由進食飲水。

１．２　造模方法　以慢性束縛方法制作大鼠肝郁脾虛證模型，將大鼠束縛于特制的束縛架上（T型束縛臺：底座寬１０cm、長２０cm、厚２．８cm，上端束縛臺長２２cm，最寬處６．６cm，前端有固定頭部的小架和適合四肢放置的凹槽，上端束縛臺有３條可調的軟

帶，兩寬一窄，分別在頭頸部、胸腰和腰背固定），３h／d，C組連續(xù)７d，D組連續(xù)２１d，隨機選取束縛時間點。整個束縛過程中動物在同一環(huán)境中，不予以進水和食物。正常對照組均散養(yǎng)于各自的飼養(yǎng)箱中３h。

１．３　取材與處理

［１，２］

　分別于第８天和第２２天清

晨８時，用２％戊巴比妥鈉４０mg／kg腹腔注射進行深度麻醉，手術剪剖開胸腔，用注射器穿刺左心室取血漿，采集血漿后于－２０℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

核磁共振（nuclearmagneticresonance，NMR）測量前樣品準備：取出血漿，常溫解凍，用德國Ep１０min），取上清３００μl，添加０．１％２，２，３，３，三甲基甲硅烷基丙酸｛３（trimethylsiyl）［２，２，３，３H４］

２

pendorf公司產(chǎn)５４２４型離心機離心（１４０００r／min，

５mm樣品管中，混勻，于４℃冰箱保存，備用。

propionate，TSP｝重水溶液１００μl、２００μlD２O于

１．４　NMR數(shù)據(jù)采集　在軍事醫(yī)學科學院生物醫(yī)學分析中心核磁共振實驗室進行檢測，２７℃條件下，在VarianUnityInova６００M超導傅立葉變化核磁共振波譜儀上調用弛豫時間編輯（CarrPurcelleddydelay，LED）相關脈沖序列，采用預飽和方式MeiboomGill，CPMG）和擴散編輯（longitudinal

抑制水峰，飽和時間為２s，混合時間為０．１５s，譜寬８０００Hz，采樣點數(shù)３２k，累加次數(shù)６４次，預飽和頻

率和中心頻率都在水峰位置。自由感應衰減（freeinductiondecay，F(xiàn)ID）信號經(jīng)過３２k傅立葉變換轉為一維NMR譜圖。以TSP為化學位移參考峰的位置，設為０ppm。調用VNMR軟件中的程序將

１

６．０～０ppm（LED），每段為０．０４ppm，進行分段積分。將積分數(shù)據(jù)歸一化之后，以文本文件或Excel文件貯存，用于模式識別分析。

H譜按默認值，分別從４．５～０．５ppm（CPMG）以及

中國科技論文在線

·３０９·

中西醫(yī)結合學報２００７年５月第５卷第３期　JournalofChineseIntegrativeMedicine，May２００７；Vol．５，No．３

１．５　主成分分析　將積分值進行中心化和比例換算Umea，用）SIM進C行A主P成１０分．０軟件包分析（（瑞典principal，Umetcoricsmponent

AB，analynentssis，P，CPC），利A）用，求PC出對主各成組大分鼠（principal清的代compo謝組分

進行分析，必要時進行判別分血析（partialleastsquaresdiscriminateanalysis，PLSDS）。2　結　果

２．１　四組動物血清１

HNMR圖譜　見圖１。

圖1　四組動物血清的典型1HNMR譜圖

Figure1　Serumspectraof600MHz1HNMRin4groups

A：GroupcontA（７roldgronormD：upGroup）al；controClgroup）；B：GroupB（２１dnormal

D：Gro（２１updCstress（７dgrostressup）．

group）；

２．２　時點相同的正常對照組與模型組動物血清１

NMR譜模式識別分析　A、C兩組動物血清LED

H

實驗１

LED實驗表明HNMR譜的波峰積分值的：A、C兩組大致以tP５CA軸分結果見圖開，A組２樣

。本中極低密度脂蛋白（verylowdensitylipoprotein，LDVLDLL）（）０和．８７低、密０．９１度脂、０蛋．９５白（和low０．９９）density、高密lipopro度脂蛋tein白，

（highdensitylipoprotein，HDL）（０．８３）、膽堿

（３．２３和３．２７）、N乙酰糖蛋白（Nacetylglycoprotein長鏈脂肪，NAC酸）（１NA．３１C１（２、１．２３．０７）、１等．２７化、１合．３６物和含量１．較３９）高、NAC；C組

２（２．１５）以及１．５９ppm處未知化合物含量較高。峰積分值的B、D兩組動物血清PCA結果見L圖ED３實驗１

。B、DH兩N組M樣本R譜的間波

沿t中４軸方向基本LDL（０．８７、分開０．９１。和從因１．２７）子載以及荷圖上化學看位移，B在組樣４～本５左右的含氧脂肪酸、不飽和脂肪酸等化合物的含量較高；D組樣本中LDL含量不高，NAC１（２．０７）、

酸含量較高NAC２（２．１６）。

及化學位移在１～３之間的飽和脂肪

波峰積分值的A、C兩組動物血清PLSDA結果見圖CPMG實４驗１。CHPMNGMR實驗結譜的

果表明，A組和C組組內樣本間個體差異較大，且點c５與其他點有明顯差異。在排除點c５的基礎上

進行PLSDS。從得分圖中可以看出，A、C兩組可被圖中所示虛線大致分開。從因子載荷圖中可以看出，A組樣本中乳酸（１．３６、１．３８、１．４、４．１６和４．１２）、丙氨酸（１．４４）、脂類化合物（０．９２和１．３６）、血糖（３～４）、NAC２（２．１６）以及谷氨酸（２．４）含量較高；而C組樣本中NAC１（２．０８）、小分子化合物（１．１２）以及乙醇和１．２ppm與３．４ppm所代表的未知化合物含量較高。兩組都未能分開B和D組進行的。

CPMG實驗，PLSDS和PCA

２．３　不同時點的正常對照組組間和模型組組間的動物血清１

物血清LEDH實驗NMR１H譜模NM式R識譜的波峰積分值的別分析　A、B兩組PC動結果見圖５。LED實驗表明：A、B兩組被圖中所示A

虛線較好地分開。因子載荷圖結合原始圖譜分析，和A組樣本中１．３５）、膽V堿LDL（３．２３和LDL、３．２７）（０．以８７及、０不．９１飽、１和．２７脂、肪１．酸３１（１．９９、５．３１和５．３５）等化合物含量較高；B組僅化學位移在３～４之間的可能為含氧脂肪酸的化合物含量較高。

峰積分值的C、D兩組動物血清PCA結果見LE圖D６實驗１。C、DH兩N組M分組R譜的趨波勢明顯，但是點c６與本組其他樣本間有明顯不同。排除c６后仍進行PCA分析，得分圖中可看出，C、D兩組沿t１軸能較好地分開，因而t１軸方向表示組間差異；各組內樣本沿t２軸方向散開，因而t２軸方向表示組內差異。因子載荷圖結合原始譜圖分析，C組樣本中VLDL和LDL（０．８７、０．９１、１．２７、１．３１和１．３５）、膽堿（３．２３、３．２７）以及不飽和脂肪酸（５．３１、５．３５）等化合物含量較高；而D組中僅化學位移在３～４之間的可能為含氧脂肪酸的化合物和NAC含量較高。

A、B兩組動物血清CPMG實驗１

波峰積分值的PCA結果見圖７。CPMHGN實M驗表明R譜的

，，子載荷圖中可以看出A、B兩組樣本可被如，圖所A組樣本中乳酸示虛線大致分（１．開３６）。、蘇氨從因

酸（１．３２）、脂類化合物（０．９２、０．９６）、丙氨酸（１．５２）、小分子化合NAC１（２．０８）物、含３羥基丁酯量較高；而（１B．２８）組以及樣本中２～血３糖之間（３的～４）、谷氨酸（２．４４）、醋酸（１．９６）及１．４８ppm和

中國科技論文在線

·３１０·

中西醫(yī)結合學報２００７年５月第５卷第３期　JournalofChineseIntegrativeMedicine，May２００７；Vol．５，No．３

１．２４ppm處所表示的未知化合物含量較高。波峰積分值的PCA結果見圖８。C、D兩組樣本沿t２軸顯示出一定的分組趨勢，但兩組內樣本間差異太大，而且c５和d１兩樣本與其他樣本間有明顯不同。排除c５和d１后對剩余數(shù)據(jù)進行PCA分析，從得分圖中可看出，兩組樣本被圖中所示虛線分開。從因子載荷圖中可看出，C組樣本中脂類化合物（０．９６、０．８９、０．９２、１．３２和１．３６）、血糖（３～４）、３．４ppm處所表示的化合物含量較高；D組樣本中NAC１（２．０８）、NAC２（２．２），以及１．２４ppm和

C、D兩組動物血清CPMG實驗HNMR譜的

１

乳酸（１．４、４．１６）、醋酸（１．９６）、膽堿（３．２４）、１．４８ppm等處化合物含量較高。

２．４　對１HNMR圖譜及模式識別的進一步分析　

各正常對照組圖中主成分積分值基本集中分布于橢圓形散點圖（９５％置信區(qū)內）的４個區(qū)域，各正常對照組間無明顯交叉和重疊。對其進一步分析發(fā)現(xiàn)，

與正常對照組相比，C、D兩組中醋酸（１．９９、４．１２、４．１６）及３．４４ppm的未知化合物的譜峰相對積分面積明顯增高而乳酸（１．３４）、酪氨酸（６．９５、７．２７）和明顯下降。見圖１、２、３和

４。

LDL（０．８７、０．９、０．９５和０．９９）的譜峰相對積分面積

圖2　A、C兩組血清代謝組PCA分值（t［4］vst［5］）散點分布和因子載荷（p［4］vsp［5］）圖（擴散編輯）Figure2　PCAscore（t［4］vst［5］）andloading（p［4］vsp［5］）plotsforgroupsAandCserumspectra（LED）

A：GroupA（７dnormalcontrolgroup）；C：GroupC（７dstressgroup）．

圖3　B、D兩組血清代謝組PCA分值（t［3］vst［4］）散點分布和因子載荷（p［3］vsp［4］）圖（擴散編輯）Figure3　PCAscore（t［3］vst［4］）andloading（p［3］vsp［4］）plotsforgroupsBandDserumspectra（LED）

B：GroupB（２１dnormalcontrolgroup）；D：GroupD（２１dstressgroup）．

圖4　A、C兩組血清代謝組PLSDS分值（t［1］vst［2］）散點分布和因子載荷（wc［1］vswc［2］）圖（弛豫編輯）Figure4　PCAscore（t［1］vst［2］）andloading（wc［1］vswc［2］）plotsforgroupsAandCserumspectra（CPMG）

A：GroupA（７dnormalcontrolgroup）；C：GroupC（７dstressgroup）．

中國科技論文在線

·３１１·

中西醫(yī)結合學報２００７年５月第５卷第３期　JournalofChineseIntegrativeMedicine，May２００７；Vol．５，No．３

圖5　A、B兩組血清代謝組PCA分值（t［1］vst［2］）散點分布和因子載荷（p［1］vsp［2］）圖（擴散編輯）Figure5　PCAscore（t［1］vst［2］）andloading（p［1］vsp［2］）plotsforgroupsAandBserumspectra（LED）

A：GroupA（７dnormalcontrolgroup）；B：GroupB（２１dnormalcontrolgroup）．

圖6　C、D兩組血清代謝組PCA分值（t［1］vst［2］）散點分布和因子載荷（p［1］vsp［2］）圖（擴散編輯）Figure6　PCAscore（t［1］vst［2］）andloading（p［1］vsp［2］）plotsforgroupsCandDserumspectra（LED）

C：GroupC（７dstressgroup）；D：GroupD（２１dstressgroup）．

圖7　A、B兩組血清代謝組PCA分值（t［2］vst［3］）散點分布和因子載荷（p［2］vsp［3］）圖（弛豫編輯）Figure7　PCAscore（t［2］vst［3］）andloading（p［2］vsp［3］）plotsforgroupsAandBserumspectra（CPMG）

A：GroupA（７dnormalcontrolgroup）；B：GroupB（２１dnormalcontrolgroup）．

圖8　C、D兩組血清代謝組PCA分值（t［1］vst［2］）散點分布和因子載荷（p［1］vsp［2］）圖（弛豫編輯）Figure8　PCAscore（t［1］vst［2］）andloading（p［1］vsp［2］）plotsforgroupsCandDserumspectra（CPMG）

C：GroupC（７dstressgroup）；D：GroupD（２１dstressgroup）．

三億文庫3y.uu456.com包含各類專業(yè)文獻、文學作品欣賞、中學教育、各類資格考試、應用寫作文書、專業(yè)論文、生活休閑娛樂、大鼠肝郁脾虛證的代謝組學研究 59等內容。

12

　

　

下載地址：大鼠肝郁脾虛證的代謝組學研究 59.Doc

　　【】

最新搜索

大鼠肝郁脾虛證的代謝組學研究

文化創(chuàng)新 基礎知識過關檢測

財經(jīng)英語單詞--審計

2016年內蒙專技繼續(xù)教育 目標與時間管理 考試題及答案10

六年級語文第一學期中段測試題

病殘兒鑒定所需資料

江蘇省鹽城市初級中學2014屆中考政治6月模擬試題

考點 遺傳信息的轉錄和翻譯

日立MCA電梯故障代碼表 (1)

領導班子蹲點調研情況記錄表

  本文關鍵詞：大鼠肝郁脾虛證的代謝組學研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：46484