【摘要】：目的 觀察推拿對(duì)腦癱(Cerebral palsy,CP)幼鼠海馬炎癥細(xì)胞因子TNF-α和IL-10蛋白表達(dá)的影響及其DNA甲基化水平,探索推拿對(duì)腦癱幼鼠海馬炎癥的拮抗作用及機(jī)制。方法 從91只3日齡正常SD幼鼠中篩選符合研究標(biāo)準(zhǔn)的39只雄性幼鼠,隨機(jī)分為3組:實(shí)驗(yàn)組(n=13)、模型對(duì)照組(n=13)和空白對(duì)照組(n=13),實(shí)驗(yàn)組和模型對(duì)照組采用左側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎聯(lián)合缺氧3.5h的方法制備腦癱模型,空白對(duì)照組不予處理。造模后第二天(即出生后第5天,Postnatal 5 days,P5),實(shí)驗(yàn)組開(kāi)始進(jìn)行推拿干預(yù),1次/日,15 min/次,持續(xù)4周,空白對(duì)照組和模型對(duì)照組不予任何干預(yù)。三組相同的溫度、濕度、生存環(huán)境及喂養(yǎng)方法。三組相同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行動(dòng)物行為學(xué)檢測(cè),即在P26天開(kāi)始進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)(Morris Water Maze,MWM)和P31天進(jìn)行跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)(Step-down Test,ST)以觀察其學(xué)習(xí)記憶能力。P33天將全部實(shí)驗(yàn)幼鼠處死,取海馬組織保存于-80℃環(huán)境備用。每組隨機(jī)抽取7只用蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western Blot)檢測(cè)TNF-α和IL-10的蛋白表達(dá)水平。將每組中剩余的6只隨機(jī)分為兩組,每組3只,分別采用Sequenom質(zhì)譜檢測(cè)法和焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)TNF-α和IL-10 DNA甲基化水平。結(jié)果1.水迷宮實(shí)驗(yàn)顯示,與空白對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組潛伏期時(shí)間較長(zhǎng),兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),與模型對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組潛伏期時(shí)間較短,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與空白對(duì)照組相比,模型對(duì)照組大鼠找到平臺(tái)的潛伏期明顯較長(zhǎng),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。實(shí)驗(yàn)組穿越平臺(tái)次數(shù)比模型對(duì)照組多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),與空白對(duì)照組相比,兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與空白對(duì)照組相比,模型對(duì)照組穿越平臺(tái)次數(shù)較少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。表明實(shí)驗(yàn)組Morris水迷宮成績(jī)優(yōu)于模型對(duì)照組,空白對(duì)照組優(yōu)于實(shí)驗(yàn)組和模型對(duì)照組。2.跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)顯示,實(shí)驗(yàn)組潛伏期時(shí)間長(zhǎng)于模型對(duì)照組,短于空白對(duì)照組,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與空白對(duì)照組相比,模型對(duì)照組的潛伏期時(shí)間明顯較短,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。三組跳下平臺(tái)次數(shù)比較:空白對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組模型對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組與模型對(duì)照組相比次數(shù)較少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組相比次數(shù)較多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);模型對(duì)照組跳下平臺(tái)次數(shù)多于空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。表明實(shí)驗(yàn)組跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)成績(jī)優(yōu)于模型對(duì)照組而差于空白對(duì)照組。3.western blot檢測(cè)顯示,實(shí)驗(yàn)組IL-10蛋白表達(dá)水平低于空白對(duì)照組,兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組IL-10蛋白表達(dá)水平高于模型對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。表明實(shí)驗(yàn)組IL-10蛋白表達(dá)水平高于模型對(duì)照組而低于空白對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組TNF-α蛋白表達(dá)水平高于空白對(duì)照組,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與模型對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組TNF-α蛋白表達(dá)水平較低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。表明實(shí)驗(yàn)組TNF-α蛋白表達(dá)水平低于模型對(duì)照組而高于空白對(duì)照組。4.Sequenom質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果:IL-10基因啟動(dòng)子區(qū)域,三組間4個(gè)Cp G位點(diǎn)相對(duì)甲基化率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。模型對(duì)照組IL-10基因相對(duì)甲基化率略高于空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。表明三組間IL-10基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平差異不明顯。TNF-α基因啟動(dòng)子區(qū)域中,實(shí)驗(yàn)組Cp G_8,9相對(duì)甲基化率高于模型對(duì)照組而低于空白對(duì)照組,三組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);模型對(duì)照組Cp G_3、Cp G_8,9和Cp G_14相對(duì)甲基化率低于空白對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。表明三組間TNF-α基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平有差異。5.焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)結(jié)果:實(shí)驗(yàn)組、空白對(duì)照組和模型對(duì)照組在炎癥因子IL-10的啟動(dòng)子區(qū)域的4個(gè)Cp G位點(diǎn)的DNA甲基化頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。表明三組間IL-10基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平差異不顯著。實(shí)驗(yàn)組、空白對(duì)照組和模型對(duì)照組在炎癥因子TNF-α的啟動(dòng)子區(qū)域的8個(gè)Cp G位點(diǎn)的DNA甲基化頻率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與空白對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組和模型對(duì)照組在位點(diǎn)Cp G_1、Cp G_2、Cp G_3、Cp G_4、Cp G_5、Cp G_6、Cp G_7的甲基化頻率均顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與模型對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組在位點(diǎn)Cp G_1、Cp G_2、Cp G_4、Cp G_6、Cp G_7的甲基化頻率明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。而在Cp G_8,與空白對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組和模型對(duì)照組甲基化頻率顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。表明實(shí)驗(yàn)組TNF-α基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平高于模型對(duì)照組,而低于空白對(duì)照組。結(jié)論1.推拿可提高腦癱幼鼠學(xué)習(xí)記憶能力。2.推拿可降低腦癱幼鼠海馬促炎細(xì)胞因子TNF-α蛋白表達(dá)水平,提高抗炎細(xì)胞因子IL-10的蛋白表達(dá)水平,重建腦癱炎癥的相對(duì)穩(wěn)態(tài)。3.推拿對(duì)腦癱幼鼠海馬炎癥細(xì)胞因子TNF-α和IL-10的蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié),其機(jī)制可能是推拿調(diào)控了炎癥細(xì)胞因子TNF-α和IL-10的基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平,同時(shí)IL-10蛋白表達(dá)的改變可能也與其他因素的調(diào)節(jié)有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：云南中醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R244.1
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本文編號(hào)：
2529642
