發(fā)布時(shí)間：2019-07-29 15:04

【摘要】：背景：肝硬化(hepatic sclerosis)是一種較常見的慢性肝病,其病理病因復(fù)雜且具有長期反復(fù)的特征,對肝臟造成極大的損傷。在病理組織學(xué)上可見：肝組織細(xì)胞出現(xiàn)大量的壞死、肝細(xì)胞出現(xiàn)結(jié)節(jié)性再生、肝臟內(nèi)出現(xiàn)增生和纖維性結(jié)節(jié)、肝小葉結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯破壞并出現(xiàn)假小葉的形成、肝臟逐漸變硬最后發(fā)展為肝硬化喪失正常的肝組織功能。在肝相關(guān)指標(biāo)上可見：肝硬化早期血、尿常規(guī)并無異常,肝硬化癥狀較明顯的中期開始出現(xiàn)血清中的丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alaninetransaminase, ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase, AST)、球蛋白等含量升高以及前白蛋白、白蛋白和凝血功能下降等。肝硬化的臨床上主要表現(xiàn)在肝功能的損傷,且嚴(yán)重時(shí)累及其他臟器組織,肝硬化晚期常伴隨出現(xiàn)門靜脈高壓、脾功能亢進(jìn)、腦組織損傷、消化系統(tǒng)出血等并發(fā)癥[2]。目前的研究認(rèn)為,肝硬化的致病機(jī)制主要有肝成纖維細(xì)胞和肝星型細(xì)胞的增殖與遷移,炎癥引起的氧化應(yīng)激,以及肝細(xì)胞凋亡等。近年來,肝硬化的發(fā)病率日益升高,而因其病理病因較復(fù)雜,使得目前對其發(fā)病機(jī)制及治療干預(yù)方法依然不甚明了,已經(jīng)成為備受關(guān)注的社會健康問題。紅花為菊科植物,含紅花黃色素和紅花苷,紅花苷經(jīng)鹽酸水解后,可以得葡萄糖和紅花素；還含15a,20β-二羥基-△4-娠烯-3-酮；除此之外還含有脂肪油稱紅花油,是棕櫚酸、花生酸、硬脂酸、亞麻酸、油酸、亞油酸等的甘油酯類。紅花性味辛、溫,歸心、肝經(jīng),有抗凝血、抗血栓形成、增加冠狀動脈血流量和降低冠狀動脈阻力、擴(kuò)張血管、改善微循環(huán),降低血壓及調(diào)節(jié)血脂、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化、保肝、免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤等作用[7-9]。中醫(yī)專家常以聯(lián)合用藥的方式將紅花用于慢性肝病或肝硬化的治療,然而其對肝硬化的抑制作用機(jī)制仍不為人知。本課題以二乙基亞硝胺誘導(dǎo)大鼠肝硬化為模型,擬驗(yàn)證紅花提取物(Carthamus tinctorius L. extract, CTLE)對肝硬化的抑制作用,并將初步探討其作用機(jī)制。目的：通過建立二乙基亞硝胺(Diethyl nitrosamine, DEN)誘導(dǎo)大鼠肝硬化模型,探討紅花提取物對肝硬化的抑制作用及其作用機(jī)制。為臨床上應(yīng)用紅花提取物治療肝硬化提供理論基礎(chǔ)。方法：1.二乙基亞硝胺誘導(dǎo)大鼠肝硬化模型：取30只健康大鼠隨機(jī)分為三組,每組10只。第一組為正常組,每周腹腔注射一次生理鹽水,每日口服生理鹽水(SI),量同實(shí)驗(yàn)組,處理8周；第二組為二乙基亞硝胺誘導(dǎo)大鼠肝硬化模型(對照組),每周腹腔注射一次70 mg/2 mL/kg濃度的二乙基亞硝胺(DEN),每日口服生理鹽水,處理8周；第三組為二乙基亞硝胺誘導(dǎo)大鼠肝硬化模型(實(shí)驗(yàn)組),每周腹腔注射一次70 mg/2 mL/kg濃度的二乙基亞硝胺(DEN),每日口服40mg/10 mL/kg濃度的紅花提取物(CTLE),處理8周。分別于處理的第0周、第4周和第8周進(jìn)行眶下竇取血,在第8周處死大鼠并取大鼠肝組織、線粒體等進(jìn)行后續(xù)檢測、對比和分析。2.每組大鼠的肝組織,經(jīng)固定、石蠟包埋、切片獲得組織切片,采用馬松三色染色法觀察組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)變化。3.分光光度法檢測大鼠血漿中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶及天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的含量。4.采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)法測定各組大鼠血漿中腫瘤壞死因子-a (Tumor necrosis factor-a, TNF-a)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1 (transforming growth factor-β1, TGF-β1)的濃度。5.差速離心法分離肝組織細(xì)胞線粒體及胞漿。6.透射電鏡觀察肝細(xì)胞線粒體形態(tài)學(xué)改變。7.采用比色法檢測肝組織和線粒體中的丙二醛(malondialdehyde, MDA)、超氧化物酶(Superoxide dismutase, SOD)的含量,觀察肝組織及線粒體氧化反應(yīng)程度。8.采用分光光度法檢測線粒體膜勢能以及線粒體中ATP的變化,Clark氧電極法檢測線粒體呼吸功能,觀察線粒體損傷情況。9.肝組織切片進(jìn)行TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)染色,觀察細(xì)胞凋亡情況。10.蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測多個(gè)組織中細(xì)胞色素C、Bax、 Pro-caspase9和caspase3的蛋白含量。結(jié)果：1、紅花提取物對肝硬化模型大鼠肝組織保護(hù)作用(1)組織形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示,紅花提取物處理的組較對照組由大鼠肝硬化引起的肝組織損傷明顯減輕,可見組織形態(tài)相對完整、組織細(xì)胞凋亡壞死減少、且炎性細(xì)胞浸潤明顯減輕、肝細(xì)胞腫大減輕、肝組織纖維化減輕等。(2)我們發(fā)現(xiàn)紅花提取物能明顯降低大鼠肝硬化引起的血漿中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶及天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的升高。(3)紅花提取物能明顯降低大鼠肝硬化引起的血漿中腫瘤壞死因子TNF-α、轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β1的濃度的升高。(4)肝硬化大鼠肝組織中MDA水平明顯升高,而SOD的含量明顯下降,說明肝硬化的大鼠肝組織中氧化應(yīng)激明顯增強(qiáng)；紅花提取物處理則能明顯降低MDA的水平,并提高SOD的含量。說明紅花提取物可以有效抑制大鼠肝硬化引起的肝組織氧化應(yīng)激。2、紅花提取物對肝硬化大鼠肝線粒體的影響。(1)通過使用透射電鏡對肝組織線粒體進(jìn)行觀察,我們發(fā)現(xiàn),空白組大鼠肝線粒體排列整齊、形態(tài)正常；對照組的大鼠線粒體腫脹且形態(tài)不規(guī)則,邊界不清晰,且大小不一致；而實(shí)驗(yàn)組線粒體的腫脹、結(jié)構(gòu)不清晰、大小不一等情況有明顯改善。(2)肝硬化大鼠的線粒體膜勢能相比空白組大幅度降低,而紅花提取物處理組線粒體膜勢能高于對照組。這說明紅花提取物處理可以幫助線粒體維持其膜勢能,維持線粒體滲透壓平衡,保護(hù)線粒體的結(jié)構(gòu)免受損傷。3、紅花提取物對肝硬化大鼠肝線粒體功能的影響。(1)肝硬化大鼠肝細(xì)胞線粒體中MDA的水平明顯升高,而SOD的含量明顯下降,說明肝硬化的大鼠肝組織細(xì)胞線粒體中氧化應(yīng)激明顯增強(qiáng)；紅花提取物處理則能明顯降低線粒體MDA的水平,并提高SOD的含量。說明紅花提取物可以有效抑制大鼠肝硬化引起的肝組織細(xì)胞線粒體的氧化應(yīng)激。(2)大鼠由于肝硬化可增強(qiáng)肝細(xì)胞線粒體中三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)的消耗,增強(qiáng)線粒體的氧化反應(yīng)程度,而紅花提取物組大鼠線粒體中ATP的消耗明顯低于對照組。與之一致的是,紅花提取物組大鼠線粒體中的磷氧比明顯高于對照組。4、紅花提取物對肝硬化大鼠肝組織細(xì)胞凋亡的影響(1)TUNEL染色結(jié)果顯示,空白組凋亡細(xì)胞較少,而相較于空白組,對照組大鼠肝組織細(xì)胞凋亡明顯增加,而紅花提取物處理的實(shí)驗(yàn)組相較于對照組凋亡明顯下降。(2)空白組中,Bax的表達(dá)以在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)為主,而對照組中Bax的表達(dá)在線粒體中顯著增強(qiáng),在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中表達(dá)顯著下降,實(shí)驗(yàn)組則相對于對照組Bax的表達(dá)變化有所降低。說明肝硬化大鼠肝受損時(shí),細(xì)胞內(nèi)Bax由質(zhì)向線粒體轉(zhuǎn)移,而紅花提取物則有效阻滯了Bax的轉(zhuǎn)移。細(xì)胞色素C的表達(dá)則與Bax呈相反的趨勢。(3)對照組肝細(xì)胞中Pro-caspase9和caspase3的表達(dá)明顯高于空白組,而紅花提取物處理后,肝細(xì)胞中Pro-caspase9和caspase3的表達(dá)較對照組明顯下降。結(jié)論：本文運(yùn)用DEN誘導(dǎo)大鼠肝硬化模型,并在模型中進(jìn)行紅花提取物處理,對大鼠肝組織損傷、炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激、線粒體功能、細(xì)胞凋亡等進(jìn)行檢測和分析,得到以下結(jié)論：1.紅花提取物能明顯減輕DEN誘導(dǎo)的大鼠肝硬化引起的肝組織損傷。2.紅花提取物能有效抑制大鼠肝硬化引起的肝組織氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)。3.紅花提取物能明顯降低大鼠肝硬化誘導(dǎo)的肝細(xì)胞線粒體氧化應(yīng)激。4.紅花提取物能維持肝細(xì)胞線粒體ATP水平、呼吸控制率及磷氧比來保護(hù)線粒體的功能。5.紅花提取物能抑制大鼠肝硬化引起的肝細(xì)胞凋亡。6.紅花提取物影響肝細(xì)胞中細(xì)胞色素C和凋亡蛋白Bax、Pro-caspase9、caspase3的表達(dá)。綜上所述,我們的研究顯示紅花提取物可以明顯抑制大鼠肝硬化誘導(dǎo)的細(xì)胞線粒體呼吸功能受損,使得線粒體內(nèi)的氧化還原反應(yīng)正常進(jìn)行,增強(qiáng)其抗氧化能力,起到減輕氧化應(yīng)激的作用,進(jìn)而減輕線粒體所受氧化損傷,另外,紅花提取物能維持線粒體膜勢能穩(wěn)定并維持線粒體內(nèi)滲透壓在一個(gè)相對正常水平,抑制Bax由細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)進(jìn)入線粒體和細(xì)胞色素C進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)基質(zhì),從而抑制凋亡因子Pro-caspase9、caspase3的表達(dá),抑制細(xì)胞凋亡,以降低肝組織氧化應(yīng)激,提高組織的抗氧化能力,并能通過抑制肝組織中的炎性細(xì)胞聚集及炎性因子釋放,顯著減輕組織的炎癥程度,從而有效保護(hù)大鼠肝硬化引起的肝功能損傷。為紅花提取物應(yīng)用于輔助治療大鼠肝硬化引起的損傷提供理論支持。
【圖文】：

組織細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)異常；而經(jīng)紅花提取物處理的實(shí)驗(yàn)組，由肝硬化引逡逑起的上述組織損傷得到明顯減輕，，可見纖維化及結(jié)節(jié)明顯減少，炎性細(xì)胞浸潤和逡逑組織細(xì)胞形態(tài)變化明顯減弱（見圖１）。逡逑WW灥逡逑圖１；紅花提取物對肝硬化大鼠肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)有保護(hù)作用（Ｘ２００）。ａ．正常組（ＳＩ逡逑組）大鼠肝組織結(jié)構(gòu)；ｂ．對照組（ＤＥＮ組）大鼠肝組織結(jié)構(gòu)；Ｃ．實(shí)驗(yàn)組（ＤＥＮ＋ＣＴＬＥ逡逑組）大鼠肝組織結(jié)構(gòu)。ＦＩ：纖維化逡逑３N２紅花提取物能明顯減輕大鼠肝硬化引起的ＡＬＴ和ＡＳＴ邋７］＜平上升逡逑當(dāng)肝硬化大鼠的肝紐織出現(xiàn)纖維化時(shí)，血清中兩氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ＡＬＴ）與天冬逡逑氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ＡＳＴ）的含量會X椄摺Ｎ頤羌觳飭耍茸櫬笫蟪贍：螅爸�、４周、ｄ撥辶x涎�清中ＡＬＴ、Ａ�櫻緣暮�量。发现生理盐水讬{鮮雋較鈧副暾�常稳定，颖K幾斡不�辶x希保板義

本文編號：2520576