【摘要】：目的:本文旨在分離和純化鹽膚木三萜成分(TER)并探討其通過作用于結直腸癌(CRC)酸性代謝產物以及微環(huán)境進而發(fā)揮抗結直腸癌作用的機制。方法:將鹽膚木根莖的60%乙醇粗提物分別用石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、正丁醇萃取,選擇1-20min內出峰最多的部位進一步用二氯甲烷-甲醇梯度洗脫;MTT法檢測各洗脫成分的抗腫瘤效應;MTT法比較正常腸上皮HCoEpiC細胞和結腸癌SW620細胞對TER的敏感性;流式細胞儀檢測SW620細胞凋亡情況;同時采用CT26小鼠結腸癌細胞建立小鼠皮下瘤模型,并給予不同濃度的TER處理,以陽性藥5-Fu作為對照,測量腫瘤體積并計算抑瘤指數。通過HE染色、免疫組化染色以及Tunnel染色分析小鼠腫瘤組織,觀察TER治療后的腫瘤組織形態(tài)變化、核增殖抗原Ki67的表達以及小鼠體內腫瘤組織凋亡的情況。試劑盒測定SW620細胞的葡萄糖攝取率和乳酸生成率;基質膠侵襲試驗測定SW620細胞的侵襲能力;Western blot檢測SW620細胞的糖酵解關鍵酶、H~+交換相關蛋白以及酸敏感離子通道(ASIC)家族成員的表達;檢測SW620細胞中MMPs蛋白的表達,免疫組化法檢測腫瘤組織中MMP-9蛋白的表達;結果:HPLC檢測三萜類成分主要存在于二氯甲烷洗脫部位,但雜質較多,主峰不明顯,用二氯甲烷-甲醇進一步梯度洗脫后,得到的9號樣品1-20 min內出峰分離度較好,主峰明顯,含有樺木酸濃度為0.528 mg/mL,樺木酮酸濃度為0.632 mg/mL,將9號樣品作為TER進行后續(xù)研究。MTT結果顯示,TER可以有效抑制HCT116和SW620兩種結腸癌細胞的增殖,其抑制HCT116細胞的IC_(50)值為62.27μg/mL,抑制SW620細胞的IC_(50)值為53.31μg/mL。但對正常腸上皮細胞HCoEpiC無顯著抑制作用,200μg/mL濃度時的抑制率僅為32%。在體實驗結果也表明TER可以有效抑制小鼠腫瘤的生長,HE染色結果顯示TER可以使腫瘤組織出現(xiàn)損傷和壞死,免疫組化實驗結果表明TER下調腫瘤組織中核增殖抗原Ki67的表達;流式細胞術結果顯示100μg/mL濃度的TER顯著促進SW620細胞凋亡,P0.01,同時Tunnel染色結果顯示經不同濃度TER治療后的小鼠腫瘤組織中凋亡細胞數目增多。TER可以顯著抑制SW620細胞的葡萄糖攝取和乳酸生成(100μg/mL濃度時,P0.001),并下調糖酵解關鍵蛋白GLUT1、PKM2和LDHA以及H~+交換相關蛋白MCT1和NHE1的表達,同時ASIC2和鈣調神經磷酸酶/活化T細胞核因子(NFAT)通路蛋白的表達均被下調。TER處理SW620細胞后,Western blot檢測到MMP-2、MMP-9蛋白的表達減少,同時基質膠侵襲試驗結果顯示SW620細胞的侵襲能力降低;在TER治療后的小鼠腫瘤組織中觀察到MMP-9蛋白的表達被下調。結論:我們的研究結果表明了從鹽膚木中提取的TER可以通過靶向CRC酸性微環(huán)境并抑制ASIC2誘導的鈣調神經磷酸酶/NFAT途徑,有效抑制CRC細胞的生長和侵襲,可以作為治療結直腸癌的輔助療法。
【學位授予單位】：江蘇大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R284;R285
【圖文】：

處理人結腸癌 HCT116 細胞 24 小時，如圖 2.2 A 所示，2 號，9 號，11 號，13號，18 號，75 號，82 號和 88 號對 HCT116 細胞增殖呈現(xiàn)較好的抑制效果。接著用這8個組分處理SW620細胞24小時，從圖2.2 B可以看出9號樣品對SW620細胞的抑制效果明顯優(yōu)于其他幾個組分，并且在經過培養(yǎng)基稀釋后 9 號能夠較好地分散于培養(yǎng)基中，因此我們選擇了 9 號組分作為鹽膚木總三萜成分（TER）進行后續(xù)的研究。如圖 2.2 C 所示，用倒置顯微鏡觀察 TER 處理后的 SW620 細胞生長情況，結果發(fā)現(xiàn)隨著劑量的增加，細胞數量明顯減少并且出現(xiàn)明顯的形態(tài)學變化，細胞逐漸皺縮變圓。A

162.4 本章小結本章研究首先通過乙醇回流方法對鹽膚木進行粗提后用乙酸乙酯、石油醚、二氯甲烷萃取，根據標準品的最大吸收波長選擇檢測波長，并根據其峰形調整流動相確定HPLC色譜條件。采用HPLC測定三萜類成分主要存在于二氯甲烷部位，圖 2.3 鹽膚木總三萜中的化學成分和含量Fig.2.3 Component and Content of triterpenoids of Rhus chinensis Mill（注：（A）鹽膚木總三萜類化合物的 HPLC 圖譜。（B）樺木酸，樺木醇，樺木酮酸和半乳酸對照品。）

鹽膚木三萜成分分離及其抗結直腸癌作用機制研究R 對結直腸癌的細胞選擇性毒性了研究 TER 是否具有腫瘤細胞的選擇性毒性，用不同的濃度的 T結腸癌 SW620 細胞與人正常結腸上皮細胞 HCoEpiC 細胞 24 h。所示，在25~200 μg/mL濃度范圍內，相同濃度下的TER處理后，細胞活性顯著高于 SW620 細胞的活性（P<0.05）,顯示出較低的敏mL 的 TER 作用下， HCoEpiC 細胞的存活率為 68 %左右， 而存活率僅為 27 %左右。 此結果說明 TER 具有選擇性細胞毒性細胞的靶向性。

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 張慧敏;包含;付蓉;劉丹;劉美娜;;醫(yī)院結直腸癌治療質量評價指標體系的建立[J];中國醫(yī)院統(tǒng)計;2015年01期

2 陶杰夫;;“吃貨”需注意的癌癥——結直腸癌[J];消費者報道;2015年05期

3 商少華;李學舜;;不同手術方式治療結直腸癌腹膜轉移患者預后效果分析[J];世界最新醫(yī)學信息文摘;2019年97期

4 于新;朱藜果;吳建維;雷平光;王麗萍;崔毅;張盛洪;;中國南方結直腸癌平均風險人群低劑量聚乙二醇方案腸道準備質量調查[J];廣東醫(yī)學;2019年22期

5 楊佳;于君;;飲食、腸道微生態(tài)與結直腸癌[J];中華結直腸疾病電子雜志;2019年06期

6 申燕;;浙江省結直腸癌臨床病理、預后調查分析[J];中國地方病防治雜志;2018年06期

7 易禮智;程征宇;王琴;徐輝;;泛素化特異性蛋白酶18在結直腸癌中的表達及其臨床意義[J];西南軍醫(yī);2018年06期

8 孫燕;顧晉;汪建平;;中國結直腸癌診療規(guī)范(2017年版)[J];上海醫(yī)學;2018年08期

9 吳凡;;結直腸癌早期診斷研究進展[J];臨床醫(yī)藥文獻電子雜志;2018年A3期

10 袁園;;預防結直腸癌 做自己能做的[J];江蘇衛(wèi)生保健;2019年03期

相關會議論文 前10條

1 ;結直腸癌診療規(guī)范(2010年版)[A];2015年玉溪市普外科年會論文匯編[C];2015年

2 徐至理;郭勇;;提高結直腸癌生存率的中西醫(yī)配合治療思考[A];第十七屆全國中西醫(yī)結合腫瘤學術大會摘要集[C];2019年

3 夏文杰;邱福銘;黃建;;白介素-8與結直腸癌預后、臨床特點相關性薈萃分析[A];浙江省免疫學會第十次學術大會論文集[C];2016年

4 王曉學;汪建平;饒本強;鄧麗;黃緣;曾廣正;陳誠;;結直腸癌患者和健康人群糞便菌群及代謝產物的差異性研究[A];第十八屆中國中西醫(yī)結合學會大腸肛門病專業(yè)委員會學術會議暨甘肅省第五屆結直腸肛門外科學術年會論文匯編[C];2015年

5 阮錦成;崔q輝;卜賀啟;吳霜;蔡珂;潘海強;沈鋒;;結直腸癌淋巴結轉移相關因素的研究進展[A];第十八屆中國中西醫(yī)結合學會大腸肛門病專業(yè)委員會學術會議暨甘肅省第五屆結直腸肛門外科學術年會論文匯編[C];2015年

6 練睿;;以急性癥狀首發(fā)的青年結直腸癌患者三例臨床分析[A];中華醫(yī)學會急診醫(yī)學分會第17次全國急診醫(yī)學學術年會論文集[C];2014年

7 陳智飛;李一權;孫麗麗;胡寧寧;周曄;李霄;金寧一;;雙特異性溶瘤腺病毒對結直腸癌的體內外抑制研究[A];第九屆全國免疫學學術大會論文集[C];2014年

8 何超;勞偉峰;;結直腸癌外科治療進展[A];2009年浙江省腫瘤外科學術年會暨腫瘤外科規(guī)范化診治學習班論文匯編[C];2009年

9 何超;朱洪波;;結直腸癌的生物治療[A];2009年浙江省腫瘤外科學術年會暨腫瘤外科規(guī)范化診治學習班論文匯編[C];2009年

10 萬德森;;進一步提高結直腸癌療效的思考[A];2009年浙江省腫瘤學術年會暨腫瘤診治新進展學習班論文匯編[C];2009年

相關重要報紙文章 前10條

1 周舟;血液診斷新方法提高結直腸癌早篩準確率[N];中國科學報;2020年

2 記者 李惠鈺;國內結直腸癌靶向治療有新選擇[N];中國科學報;2017年

3 本報特約撰稿 蔡德山;增長62.8% 結直腸癌“新寵”靶向藥增勢猛[N];醫(yī)藥經濟報;2019年

4 本報記者 張思瑋;居家篩查為結直腸癌防治“提速”[N];中國科學報;2019年

5 本報記者 張思瑋;結直腸癌診治還須“早”發(fā)力[N];中國科學報;2018年

6 劉洋 整理;遠離結直腸癌 從改變生活方式開始[N];健康報;2019年

7 健康時報融媒體報道團 李桂蘭 呂霖 劉玫妍 毛圓圓 董穎鈺 楊妙霞 整理;調查:中國首個大規(guī)模結直腸癌患者生存調查[N];健康時報;2019年

8 邱成剛;結直腸癌患者堅持健身或能緩解病情[N];中國科學報;2019年

9 本報記者 陶婷婷;經常肚子痛、腹瀉？小心結直腸癌緊隨此頑癥來臨[N];上�？萍紙�;2019年

10 本報記者 楊柳;關注結直腸癌——莫讓“出路”受阻[N];中國醫(yī)藥報;2018年

相關博士學位論文 前10條

1 崔金元;TRIM28在結直腸癌轉移過程中的作用及機制研究[D];華中科技大學;2019年

2 王光輝;ANLN、SHMT2以及PHKβ蛋白在結直腸癌中的臨床意義及機制研究[D];上海交通大學;2016年

3 楊林森;SUMO化修飾在表觀調控及腫瘤細胞生物學功能調控中的作用[D];上海交通大學;2016年

4 王蒲雄志;NDRG1對結直腸癌干性的影響及其調控機制[D];上海交通大學;2016年

5 張曉健;Cortactin在結直腸癌增殖、轉移中的作用及其機制研究[D];上海交通大學;2016年

6 王霄;MEP1A對結直腸癌生物學行為的影響及作用機制的初步研究[D];上海交通大學;2016年

7 陳健;PAK6在結直腸癌中的功能及其表達調控機制研究[D];上海交通大學;2016年

8 王敬濤;驅動蛋白KIF26B在結直腸癌中的表達、臨床意義和相關機制研究[D];上海交通大學;2016年

9 劉永鋒;NLRX1基因敲除對結直腸癌發(fā)生發(fā)展的影響及相關機制研究[D];上海交通大學;2014年

10 王欣生;長鏈非編碼RNA HMF1A-AS1和BX357664對結直腸癌細胞增殖和遷移的功能及機制研究[D];山東大學;2019年

相關碩士學位論文 前10條

1 靳倩倩;Nrf2和Keap1在結直腸癌中的表達及臨床意義[D];甘肅中醫(yī)藥大學;2019年

2 陳亞君;武威市1995-2016年結直腸癌發(fā)病趨勢與空間聚集性分析[D];甘肅中醫(yī)藥大學;2019年

3 袁博;結直腸癌PD-L1的表達與臨床病理特征關系的Meta分析[D];甘肅中醫(yī)藥大學;2019年

4 吳冰冰;不同解剖部位的結直腸癌病理特征及患者臨床特點的比較分析[D];吉林大學;2019年

5 曹英豪;結直腸癌并發(fā)完全性腸梗阻支架置入術作為手術過渡是否會增加神經浸潤率？[D];華中科技大學;2019年

6 裴知音;基于線粒體作為藥物載體用于結直腸癌的治療效應的研究[D];華中科技大學;2019年

7 牛瑞栩;RNA結合蛋白HuR在結直腸癌中對CREPT蛋白表達影響的研究[D];燕山大學;2019年

8 董莎莎;FXYD5基因在結直腸癌中的表達及意義[D];內蒙古醫(yī)科大學;2019年

9 林超;PTEN、MTDH、GATA3在結直腸癌變過程中的表達及意義[D];內蒙古醫(yī)科大學;2019年

10 熊瑛;γ-氨基丁酸（GABA）對結直腸癌的影響及其分子機制探討[D];上海交通大學;2016年

本文編號：2746488