發(fā)布時(shí)間：2020-07-05 15:54

【摘要】：目的:以模擬糖尿病并發(fā)抑郁癥(DD)狀態(tài)下胎鼠海馬神經(jīng)元為研究對(duì)象,探討海馬神經(jīng)元突觸可塑性障礙導(dǎo)致DD發(fā)生的分子機(jī)制,并給予中藥復(fù)方左歸降糖解郁方干預(yù),為DD發(fā)病機(jī)制的研究及防治提供新的思路與靶點(diǎn)。方法:1、取7-10d的胎鼠海馬進(jìn)行分離、純化、培養(yǎng),神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)免疫細(xì)胞化學(xué)染色進(jìn)行細(xì)胞鑒定。2、將培養(yǎng)的海馬原代神經(jīng)元隨機(jī)分為六組:空白組、對(duì)照組、模型組、NR阻斷劑組(MK-801)、陽(yáng)性藥組(二甲雙胍+氟西汀)、左歸降糖解郁方組。根據(jù)分組情況,模型組加入高糖(15 mmol/L)和皮質(zhì)酮(50μmol/L),對(duì)照組、陽(yáng)性藥組、左歸降糖解郁方組于造模后分別加入體積分?jǐn)?shù)10%的空白血清、陽(yáng)性藥含藥血清、左歸降糖解郁方含藥血清,空白組加入10%的培養(yǎng)液,阻斷劑組加入MK-801(10μmol/L),干預(yù)18h。采用高內(nèi)涵細(xì)胞成像分析技術(shù)(High Content Analysis,HCA)檢測(cè)CRHR1、GR、NR2A、NR2B、CaMK II、SynGap蛋白的表達(dá);采用全細(xì)胞膜片鉗記錄海馬神經(jīng)元細(xì)胞mEPSC,比較各組神經(jīng)元細(xì)胞mEPSC頻率和電流幅度的差異。結(jié)果:1、經(jīng)倒置顯微鏡觀察、NSE免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定,所培養(yǎng)細(xì)胞為海馬神經(jīng)元細(xì)胞,且純度達(dá)95%以上。2、經(jīng)HCA分析顯示,空白組神經(jīng)元形態(tài)完整,胞體飽滿,突觸之間相互交織成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。與空白組比較,模型組和對(duì)照組海馬神經(jīng)元萎縮,突觸斷裂或神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)消失,CRHR1、NR2A、NR2B和CaMKII蛋白熒光強(qiáng)度上升,GR和SynGAP蛋白熒光強(qiáng)度降低(P0.01)。與對(duì)照組比較,NR阻斷劑組、陽(yáng)性藥組和左歸降糖解郁方組突觸連接恢復(fù),NR2A、NR2B和CaMKII蛋白熒光強(qiáng)度降低,SynGAP蛋白熒光強(qiáng)度上升(P0.01或P0.05);陽(yáng)性藥組和左歸降糖解郁方組CRHR1蛋白熒光強(qiáng)度降低,GR蛋白熒光強(qiáng)度上升(P0.01),而NR阻斷劑組則無(wú)明顯差異。膜片鉗檢測(cè),與空白組比較,模型組和對(duì)照組海馬神經(jīng)元細(xì)胞mEPSC的頻率和電流幅度都顯著上升(P0.01);與對(duì)照組比較,NR阻斷劑組、陽(yáng)性藥組和左歸降糖解郁方海馬神經(jīng)元細(xì)胞mEPSC的頻率和電流幅度顯著下降(P0.01)。結(jié)論:左歸降糖解郁方對(duì)模擬DD狀態(tài)下海馬神經(jīng)元GR、CRHR1、NR2A、NR2B蛋白的調(diào)控作用,以及對(duì)DD海馬神經(jīng)元突觸可塑性結(jié)構(gòu)與功能的調(diào)控作用,可能是抗DD大鼠神經(jīng)元損傷的保護(hù)機(jī)制。
【學(xué)位授予單位】：湖南中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285.5
【圖文】：

8經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。經(jīng) HCA 檢測(cè)，NSE 染色后陽(yáng)性者呈綠色熒光，陽(yáng)性率達(dá) 95%以上，該陽(yáng)性細(xì)胞即海馬神經(jīng)元。結(jié)果見(jiàn)圖1。圖 1 海馬原代神經(jīng)元的一般形態(tài)學(xué)觀察及鑒定A：培養(yǎng) 7d 的細(xì)胞；B：NSE 免疫細(xì)胞化學(xué)染色；標(biāo)尺：100μm3.2 對(duì) GR、CRHR1 蛋白表達(dá)的影響經(jīng)高內(nèi)涵成像系統(tǒng)分析后顯示，藍(lán)色熒光為 DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核，橙黃色熒光為 R-PE標(biāo)記的細(xì)胞骨架，綠色熒光為FITC 標(biāo)記的GR 或CRHR1，而熒光強(qiáng)度與蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)�？瞻捉M神經(jīng)元神經(jīng)元形態(tài)完整，各突觸之間相互接觸形成致密的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，組織碎片少。與空白組比較，對(duì)照組與模型組的突觸之間連接斷裂，碎片增多，GR 熒光強(qiáng)度值明顯下降，CRHR1 熒光強(qiáng)度值明顯上升

含藥血清組和左歸降糖解郁方含藥血清組、NR阻斷劑組突起與突起之間形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，陽(yáng)性藥含藥血清組和左歸降糖解郁方含藥血清組能逆轉(zhuǎn) GR 和 CRHR1 的表達(dá)，差異具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），阻斷劑組無(wú)明顯變化。結(jié)果見(jiàn)圖2-4。圖 2 各組海馬神經(jīng)元 GR 和 CRHR1 的熒光強(qiáng)度值情況A 空白組；B 模型組；C 對(duì)照組；D NR 阻斷劑組；E 陽(yáng)性藥含藥血清組；F 左歸降糖解郁方含藥血清組；與 A 比較，**P<0.01；與 B 比較，##P<0.01

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2742813