發(fā)布時(shí)間：2020-07-03 12:49

【摘要】：黃芪是我國(guó)傳統(tǒng)中醫(yī)藥中的常用滋補(bǔ)中藥材,其蜜炙品具有比生品更高的補(bǔ)中益氣、調(diào)節(jié)免疫作用,臨床常用蜜炙黃芪替代生品黃芪以提高其免疫調(diào)節(jié)等方面的療效。本研究旨在建立蜜炙、生品黃芪有效部位的分離純化方法,以及通過(guò)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥模型探討蜜炙、生品黃芪有效部位的體外抗炎活性。實(shí)驗(yàn)根據(jù)蜜炙、生品黃芪有效部位(多糖、黃酮、皂苷)極性的差異分別進(jìn)行分離。采用凝膠色譜法對(duì)蜜炙、生品黃芪多糖進(jìn)行純化,通過(guò)HPLC-ELSD的方法研究蜜炙、生品黃芪多糖的分子量范圍,通過(guò)柱前衍生化以及UPLC/Q-TOF MS技術(shù)結(jié)合面積歸一化法對(duì)蜜炙、生品黃芪多糖的組成單糖種類(lèi)與含量進(jìn)行分析;采用Poly-sery HLB固相萃取法分離純化蜜炙、生品黃芪黃酮部位與皂苷部位,應(yīng)用UPLC/Q-TOF MS技術(shù)結(jié)合面積歸一化法檢測(cè)黃酮、皂苷有效部位的化學(xué)成分和相對(duì)含量;建立LPS誘導(dǎo)的小鼠RAW264.7炎癥細(xì)胞模型,考察蜜炙、生品黃芪有效部位的細(xì)胞毒性以及對(duì)細(xì)胞因子釋放的調(diào)控,從而探討其對(duì)細(xì)胞相關(guān)炎癥因子表達(dá)的影響。蜜炙黃芪多糖分子量為298847,組成單糖種類(lèi)及含量(nmol)之比為甘露糖∶葡萄糖∶木糖∶阿拉伯糖∶葡萄糖醛酸∶鼠李糖=0.06∶28.34∶0.58∶0.24∶0.33∶0.21。生品黃芪多糖分子量為309687,組成單糖種類(lèi)及含量(nmol)之比為甘露糖∶葡萄糖∶木糖∶阿拉伯糖∶葡萄糖醛酸∶鼠李糖=0.27∶12.83∶1.63∶0.71∶1.04∶0.56。蜜炙黃芪黃酮部位與皂苷部位含量分別為96.59%與95.06%,包括4種黃酮類(lèi)成分與12種皂苷類(lèi)成分。結(jié)合本課題組前期實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果可知,黃芪蜜炙后總黃酮含量降低而總皂苷含量增加,即蜜炙后總黃酮的含量下降,尤其毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷-6"-O-丙二酸酯的含量銳減,而毛蕊異黃酮苷與黃芪總皂苷的含量有所增加。蜜炙、生品黃芪各有效部位給藥濃度在100μg/mL以內(nèi)對(duì)小鼠RAW264.7細(xì)胞均無(wú)明顯細(xì)胞毒性作用,從抑制炎癥細(xì)胞的NO與細(xì)胞因子釋放情況來(lái)看,蜜炙、生品黃芪有效部位均具有抗炎活性,且蜜炙黃芪有效部位的活性普遍強(qiáng)于生品黃芪有效部位。通過(guò)比較蜜炙黃芪各有效部位對(duì)細(xì)胞因子釋放的抑制結(jié)果可知,蜜炙黃芪皂苷部位的抗炎活性最強(qiáng),其次是蜜炙黃芪黃酮部位,最后是蜜炙黃芪多糖部位。黃芪蜜炙后多糖中葡萄糖的含量急劇增高而其余單糖的含量則有減小,提示黃芪蜜炙有利于葡萄糖的增加,原因可能為煉蜜中含有的大量葡萄糖在蜜炙過(guò)程中與黃芪多糖結(jié)合,加熱過(guò)程可能造成部分多糖的分解從而導(dǎo)致其余單糖含量的降低。蜜炙后總皂苷類(lèi)的含量有所升高而總黃酮含量降低,提示黃芪蜜炙有利于其皂苷類(lèi)成分的溶出,加熱過(guò)程可能造成某些基團(tuán)的丟失而產(chǎn)生一些化合物含量的變化。蜜炙黃芪有效部位較生品黃芪有效部位能更好地抑制炎癥細(xì)胞中細(xì)胞因子NO、IL-1β、TNF-α的釋放,推測(cè)可能由于蜜炙黃芪有效部位與生品黃芪有效部位有效成分含量以及組成的差異從而引起抗炎活性的差異。
【學(xué)位授予單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R284;R285.5
【圖文】：

鼠李糖 y = 6.4915x - 22.234 R2= 0.996142.4.5 蜜炙黃芪多糖的單糖組成分析在考察分析條件時(shí)，比較了不同的分析色譜柱對(duì)單糖衍生化產(chǎn)物的分離分析效果，通過(guò)比較了 HILIC 親水柱、BEH C18 色譜柱與 HSS T3 色譜的分離效果，最終確定本實(shí)驗(yàn)所采用的 Kinetex 1.7 μm EVO C18 柱。根據(jù)不同條件下的總離子流圖可知，當(dāng)流動(dòng)相中含有少量酸時(shí)，峰形與峰響應(yīng)強(qiáng)度能得到改善。流動(dòng)相 A 中加入少量乙酸銨則能更加良好的改善峰形。所以，經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)，最終確定的流動(dòng)相為 0.1%甲酸水-10mM 乙酸銨，以梯度洗脫的方式，能將 6 個(gè)單糖衍生產(chǎn)物分離開(kāi)來(lái)。其中，1 號(hào)峰為甘露糖，2 號(hào)峰為鼠李糖，3 號(hào)峰為葡萄糖醛酸，4 號(hào)峰為葡萄糖，6 號(hào)峰為阿拉伯糖。由圖 2-1 可知，所有單糖衍生化產(chǎn)物均能在 7 分鐘之前出峰。盡管在總離子流圖上看，葡萄糖醛酸和葡萄糖并沒(méi)有被分開(kāi)，但通過(guò)提取離子的方式可知（如圖 2-2 所示），葡萄糖醛酸與葡萄糖仍能被分辨出來(lái)。

葡萄糖醛酸、甘露糖、葡萄糖的提取離子液相圖譜

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2739683