發(fā)布時(shí)間：2020-11-09 11:10

　　 研究背景二硫化碳(Carbondisulfide,CS2)是一種具有揮發(fā)性的化學(xué)性有機(jī)溶劑和原材料,在工業(yè)上用途廣泛,接觸CS2作業(yè)的工人數(shù)量龐大。因此,CS2所致的職業(yè)危害一直是人們關(guān)注的重點(diǎn)。近幾年來,CS2對女性職業(yè)人群生殖健康的損害引起人們的關(guān)注。大量流行病學(xué)研究表明,暴露于CS2的女性職業(yè)人群的自然流產(chǎn)、早早孕丟失和出生缺陷發(fā)生率明顯高于對照組。在以前的研究中發(fā)現(xiàn),暴露于CS2的孕鼠其胚胎植入數(shù)量明顯降低。胚胎植入障礙是CS2致女性生殖損傷的重要毒性表現(xiàn)形式之一,但關(guān)于其毒作用機(jī)制我們尚不清楚。胚胎植入是一個(gè)復(fù)雜的生理過程,是妊娠建立的標(biāo)志和首要環(huán)節(jié)。蛻膜化過程和血管生成過程對成功的胚胎植入提供至關(guān)重要的作用。樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DCs),專職抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cell,APC)與胚胎植入過程息息相關(guān),一方面作為一種典型的免疫細(xì)胞,針對半抗原的胎兒調(diào)節(jié)母胎界面的免疫耐受,另一方面調(diào)節(jié)子宮的蛻膜化和血管生成過程。近幾年來,大量的證據(jù)表明在小鼠早期妊娠期間,DCs非免疫方向的調(diào)節(jié)功能已經(jīng)超越了它作為免疫細(xì)胞方向的功能,特別是最近的研究強(qiáng)調(diào)了 DCs參與調(diào)節(jié)蛻膜化和血管生成過程。研究發(fā)現(xiàn),去除植入窗口期孕鼠子宮內(nèi)的DCs后,蛻膜化過程嚴(yán)重?fù)p害并且胚胎植入失敗,發(fā)現(xiàn)植入失敗跟損害的蛻膜化過程有關(guān)。去除植入期小鼠體內(nèi)的DCs后,植入位置的血管平滑肌細(xì)胞標(biāo)志物密度減少,說明血管生成受到損害;同時(shí)用動(dòng)態(tài)磁共振成像對小鼠蛻膜血管進(jìn)行功能分析,發(fā)現(xiàn)去除體內(nèi)DCs后蛻膜血管中的血液體積減少、毛細(xì)血管滲漏物增多。以上結(jié)果說明,去除DCs不僅降低血管通透性,而且還損害血管生成和血管成熟。另外,子宮中的DCs能夠產(chǎn)生血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及其受體VEGFR,直接參與子宮血管生成過程。研究目的本研究以胚胎植入窗口期暴露于CS2,建立CS2致小鼠胚胎植入障礙的模型,觀察子宮中DCs數(shù)量的變化,分析DCs與胚胎植入之間的關(guān)系,探究機(jī)體暴露于CS2后是否通過改變DCs的數(shù)量而致胚胎植入障礙;觀察子宮蛻膜化標(biāo)志因子白細(xì)胞介素-11(Interleukin-11,IL-11)和血管生成相關(guān)因子VEGF和其配體Flt-1(VEGF1)的表達(dá)水平,闡明機(jī)體暴露于CS2后,是否通過改變DCs的數(shù)量進(jìn)一步干擾蛻膜化過程和血管生成過程,從而致胚胎植入障礙。研究方法1.動(dòng)物分組和暴露設(shè)計(jì)7-9周清潔級(jí)性成熟昆明種小鼠,雌性體重約30-35g,雄性體重約35-40g。小鼠自由飲食,自然采光。按雌雄2:1合籠,次日檢查陰栓,陰栓陽性者記為孕第1天(the first day in gestation,GDI)。設(shè)計(jì)GD4和GD5兩個(gè)暴露時(shí)間點(diǎn),GD4暴露點(diǎn)設(shè)置4個(gè)觀察終點(diǎn)(分別是孕后第5、6、7、9天),GD5暴露點(diǎn)設(shè)置3個(gè)觀察終點(diǎn)(分別是孕后第6、7、9天),染毒組按照631.4mg/kg(0.4LD50)的劑量經(jīng)腹腔注射CS2,注射體積為0.1ml/10g,對照組注射等體積橄欖油。2.樣本采集及實(shí)驗(yàn)方法在相應(yīng)的各觀察終點(diǎn)收取小鼠樣本,立即收集子宮組織樣品于-80℃冷凍保存,用于實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time Quantitative polymerase chain reaction,qPCR)和酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測。收集新鮮的子宮內(nèi)膜用于流式細(xì)胞術(shù)。小鼠摘眼球取血后,離心,收集上清液并儲(chǔ)存在-80℃低溫冰箱中,血清樣品用于ELISA檢測。3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件(SPSS 19.0)進(jìn)行分析。對于兩組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較時(shí),若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊,采用兩組獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn);若不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)則采用兩組獨(dú)立樣本的t'檢驗(yàn)。對于多組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),若方差齊,單因素方差分析(ONE-WAY ANOVA)進(jìn)行F檢驗(yàn),同時(shí)選擇Dunnett-t test進(jìn)行實(shí)驗(yàn)組與對照組指標(biāo)均數(shù)比較;若方差不齊,采用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)方法(Kruskal-WallisH法)。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。以P0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究結(jié)果1.CS2對胚胎及母體的影響胚胎毒性:胚胎植入數(shù)目觀察結(jié)果顯示,與對照組相比,GD4和GD5染毒后其胚胎植入數(shù)目分別下降了 20.6%和22.4%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),說明在植入窗口期暴露于CS2后導(dǎo)致小鼠胚胎植入障礙。胚胎發(fā)育結(jié)果顯示,染毒組的宮胚窩重、胚胎窩重、平均宮胚窩重和平均胚胎窩重與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),說明在植入窗口期暴露于CS2后對胚胎發(fā)育無顯著影響。母體毒性:母體體重觀察結(jié)果顯示,染毒期間孕鼠體重和體重增重與對照組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。母體器官系數(shù)觀察結(jié)果顯示,染毒后孕鼠心、肺、腎、卵巢、子宮等臟器系數(shù)與對照組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。說明胚胎植入期暴露于CS2對孕鼠母體無顯著影響。2.CS2對子宮內(nèi)膜樹突狀細(xì)胞數(shù)量的影響GD4染毒后,GD5觀察終點(diǎn)子宮內(nèi)膜DCs數(shù)量與對照組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),子宮內(nèi)膜DCs數(shù)量降低21%。GD6和GD7觀察終點(diǎn)子宮內(nèi)膜中DCs的數(shù)量與對照組相比均降低,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),說明GD4染毒后對GD5觀察終點(diǎn)有顯著影響。GD5染毒后,GD6和GD7觀察終點(diǎn)子宮中DCs的數(shù)量比對照組降低,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),說明GD5染毒后對子宮內(nèi)膜DCs數(shù)量無顯著影響。3.CS2對子宮蛻膜化過程的標(biāo)志因子IL-11表達(dá)水平的影響GD4染毒后,子宮組織中IL-11mRNA的表達(dá)水平,GD5、GD6、GD7觀察終點(diǎn)上表達(dá)水平與對照組相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),表達(dá)水平分別下降了 89%、88%和60%;子宮組織中IL-11蛋白質(zhì)表達(dá)水平,GD5和GD6觀察終點(diǎn)的表達(dá)水平與對照組相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),GD5表達(dá)水平上升了 83%,GD6觀察終點(diǎn)表達(dá)水平下降49%。GD5染毒后,子宮組織中IL-11mRNA的表達(dá)水平,GD6、GD7觀察終點(diǎn)上表達(dá)水平與對照組相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),表達(dá)水平分別下降78%和90%;子宮組織中IL-11蛋白質(zhì)表達(dá)水平,GD6觀察終點(diǎn)表達(dá)水平與對照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),表達(dá)水平下降72%。4.CS2對子宮組織血管生成因子VEGF和其配體Flt-1表達(dá)水平的影響子宮組織中VEGF表達(dá)的影響:①GD4染毒后,子宮組織中VEGFmRNA的表達(dá)水平,GD6、GD7觀察終點(diǎn)表達(dá)水平與對照組相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),表達(dá)水平分別下降79%和71%;子宮組織中VEGF蛋白質(zhì)的表達(dá)水平,GD6觀察終點(diǎn)表達(dá)水平與對照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),表達(dá)水平下降30%。②GD5染毒后,子宮組織中VEGFmRNA的表達(dá)水平,GD7觀察終點(diǎn)表達(dá)水平與對照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),表達(dá)水平下降了 62%;子宮組織中VEGF蛋白質(zhì)的表達(dá)水平,GD7觀察終點(diǎn)表達(dá)水平與對照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),表達(dá)水平下降36%。子宮Flt-1表達(dá)的影響:①GD4染毒后,子宮中Flt-1mRNA的表達(dá)水平,GD5、GD6、GD7觀察終點(diǎn)的表達(dá)水平與對照組相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),表達(dá)水平分別下降58%、54%和60%;子宮中Flt-1蛋白質(zhì)的表達(dá)水平,GD6、GD7觀察終點(diǎn)的表達(dá)水平與對照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),表達(dá)水平分別下降36%和46%。②GD5染毒后,子宮中Flt-1mRNA的表達(dá)水平,GD7觀察終點(diǎn)的表達(dá)水平與對照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),表達(dá)水平下降60%;子宮中Flt-1蛋白質(zhì)的表達(dá)水平,GD6、GD7觀察終點(diǎn)子宮組織的表達(dá)水平與對照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),表達(dá)水平分別下降40%和 44%。5.CS2對外周血中血管生成因子VEGF表達(dá)水平的影響GD4染毒后,外周血中VEGF蛋白質(zhì)的表達(dá)水平,GD7觀察終點(diǎn)表達(dá)水平與對照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),表達(dá)水平上升73%。GD5染毒后,外周血中VEGF蛋白質(zhì)的表達(dá)水平,GD7觀察終點(diǎn)的表達(dá)水平與對照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),表達(dá)水平上升57%。結(jié)論1.子宮蛻膜化過程和血管生成過程的損害可能是CS2致小鼠胚胎植入障礙的重要機(jī)制之一;2.樹突狀細(xì)胞可能參與了 CS2致胚胎植入障礙的過程。小鼠暴露于CS2后,可能通過減少子宮內(nèi)膜DCs的數(shù)量,進(jìn)而影響DCs對蛻膜化過程和血管生成過程的調(diào)節(jié),而導(dǎo)致胚胎植入失敗,但這種調(diào)節(jié)作用可能是有限的;3.小鼠暴露于CS2后,機(jī)體對蛻膜化過程和血管生成過程的損傷會(huì)出現(xiàn)一個(gè)短暫的調(diào)節(jié)反應(yīng);4.外周血中VEGF可作為潛在的胚胎植入障礙生物標(biāo)志物。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R114
【部分圖文】：

暴露時(shí)間點(diǎn)，ＧＤ４暴露點(diǎn)設(shè)置４個(gè)觀察終點(diǎn)（分別是孕后第５、６、７、９天），??ＧＤ５暴露點(diǎn)設(shè)置３個(gè)觀察終點(diǎn)（分別是孕后第６、７、９天），收取樣本染毒時(shí)??間和終止實(shí)驗(yàn)的時(shí)間安排見圖１。設(shè)置第９天的觀察終點(diǎn)是為了觀察０＆對胚胎??植入數(shù)目的影響，以及對母體心、肝、脾、肺、腎、卵巢、子宮等臟器的影響。??ＣＳ２易揮發(fā)且有毒性，因此與橄欖油按照１：?２０的比例現(xiàn)配現(xiàn)用，即依據(jù)當(dāng)??天需要染毒的孕鼠的體重和數(shù)量，計(jì)算并配備ＣＳ２溶液。染毒組小鼠于同一時(shí)間??點(diǎn)按照６３１．４ｍｇ／ｋｇ?（０．４ＬＤ５０）?［６１］的劑量經(jīng)腹腔注射ＣＳ２，注射體積為Ｏ．ｌｍｌ／ｌＯｇ，??對照組注射等體積橄欖油。??Ｘ??懷孕天數(shù)?￣Ｉ?小?１?１?１?１－??＜３）１?ＧＩＭ?（３３５?Ｇ３Ｄ６?ＧＤ７??ｇ？４?染毒??染毒?終點(diǎn)終點(diǎn)?＾??－麟?＾?＾?＾??圖１染毒時(shí)間和觀察終點(diǎn)安排??２１??

的體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ｐ＞〇．〇５），觀察染毒組和對照組小鼠每天的生長狀??況，小鼠生長狀況良好，無死亡情況出現(xiàn)。染毒組和對照組孕鼠每天體重?cái)?shù)據(jù)結(jié)??果顯示，ＧＤ４染毒后母體體重與對照組相比在孕第５天開始下降（圖２），ＧＤ５??染毒后母體體重與對照組相比在孕第６天開始下降（圖４），差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意??義，說明胚胎植入期暴露于ＣＳ２后對母體每天體重?zé)o顯著影響。染??毒組和對照組孕鼠每天體重增重?cái)?shù)據(jù)結(jié)果顯示，ＧＤ４染毒組和ＧＤ５染毒組孕鼠??的體重增重與對照組相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（戶＞〇．〇５），說明胚胎植入期??暴露于ＣＳ２后對母體體重增重?zé)o顯著影響。???■＊－對照組???ＧＤ４??ｉｌｎｌｌ?３０－??ｌｐｉ］??拄？??＃２０－??１０－??Ｑ?Ｊ?ｊ?，?，?，?

小鼠生長狀況良好，無死亡情況出現(xiàn)。染毒組和對照組孕鼠每天體重?cái)?shù)據(jù)結(jié)??果顯示，ＧＤ４染毒后母體體重與對照組相比在孕第５天開始下降（圖２），ＧＤ５??染毒后母體體重與對照組相比在孕第６天開始下降（圖４），差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意??義，說明胚胎植入期暴露于ＣＳ２后對母體每天體重?zé)o顯著影響。染??毒組和對照組孕鼠每天體重增重?cái)?shù)據(jù)結(jié)果顯示，ＧＤ４染毒組和ＧＤ５染毒組孕鼠??的體重增重與對照組相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（戶＞〇．〇５），說明胚胎植入期??暴露于ＣＳ２后對母體體重增重?zé)o顯著影響。???■＊－對照組???ＧＤ４??ｉｌｎｌｌ?３０－??ｌｐｉ］??拄？??＃２０－??１０－??Ｑ?Ｊ?ｊ?，?，?，?，?
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2876337