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棕櫚酸上調(diào)FAT/CD36表達致HepG2細胞脂質(zhì)積聚的機制研究

發(fā)布時間:2020-12-11 18:01
  目的觀察脂肪酸轉(zhuǎn)位酶FAT/CD36在棕櫚酸誘導的HepG2細胞內(nèi)脂質(zhì)積聚中的作用,并探討其分子機制。方法 HepG2細胞分對照組和棕櫚酸組,用Western blot、雙熒光素酶報告基因、熒光定量PCR、多聚核糖體分析檢測棕櫚酸對CD36表達、啟動子活性和蛋白翻譯效率的影響;油紅O染色和FFA定量測定反映細胞內(nèi)脂質(zhì)含量;熒光顯微鏡實時觀察細胞對FFA的動態(tài)攝入。然后將小干擾RNA轉(zhuǎn)染到HepG2細胞,構(gòu)建低表達CD36的HepG2細胞和陰性對照HepG2。用油紅O染色,FFA定量和熒光顯微鏡觀測棕櫚酸負荷的轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)脂質(zhì)積聚和FFA攝取。結(jié)果棕櫚酸能促進HepG2細胞CD36的表達,增強其啟動子活性,增加蛋白翻譯效率;棕櫚酸組細胞內(nèi)脂滴增多,FFA含量(240.17±19.83)ng/mg明顯高于對照組(144.60±53.52)ng/mg(P<0.05),脂肪酸攝取速度也明顯快于對照組;低表達CD36的HepG2細胞中CD36的mRNA和蛋白含量僅為陰性對照細胞的58%和50%。低表達CD36的HepG2細胞內(nèi)脂滴明顯少于陰性對照,FFA水平(98.38±14.18)ng/m... 

【文章來源】:第三軍醫(yī)大學學報. 2015年13期 第1308-1313頁 北大核心

【文章頁數(shù)】:6 頁

【部分圖文】:

棕櫚酸上調(diào)FAT/CD36表達致HepG2細胞脂質(zhì)積聚的機制研究


Westernblot檢測棕櫚酸對HepG2細胞CD36蛋白

棕櫚酸,HepG2細胞,內(nèi)脂


高密度圖2CD36啟動子載體的構(gòu)建及棕櫚酸對CD36翻譯效率的影響2.3棕櫚酸對HepG2細胞內(nèi)脂質(zhì)積聚的影響普通HepG2細胞用0、0.16mmol/L棕櫚酸處理24h后,正置顯微鏡觀察油紅O染色結(jié)果發(fā)現(xiàn):與對照組(Control)相比,棕櫚酸組(PA)的HepG2細胞內(nèi)橘紅色脂滴增加;同時用酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測HepG2細胞內(nèi)FFA含量發(fā)現(xiàn)棕櫚酸處理組(240.17±19.83)ng/mg較對照組(144.60±53.52)ng/mg明顯升高(P<0.05,n=4),結(jié)果與油紅O染色結(jié)果一致(圖3A)。在顯微鏡下動態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)棕櫚酸處理組的細胞對FL-C16的攝取速率較對照組加快(圖3B)。A:HepG2細胞油紅O染色及細胞內(nèi)FFA定量(×400);B:HepG2細胞對熒光標記FFA的動態(tài)攝取攝像(×200)圖3棕櫚酸對HepG2細胞內(nèi)脂質(zhì)積聚的影響2.4抑制CD36表達對HepG2細胞CD36表達及細胞內(nèi)脂質(zhì)積聚的影響我們將CD36-siRNA和NC-siRNA瞬時轉(zhuǎn)入HepG2細胞成功構(gòu)建了低表達CD36的HepG2細胞(CD36-siRNA-HepG2,CD36RNAi)和陰性對照HepG2(NC-siRNA-HepG2,NC)。CD36RNAi的HepG2中CD36mRNA與蛋白分別為NC組的(0.58±0.08)(P<0.05,n=6),(0.50±0.10)(P<0.05,n=3)。給予CD36RNAi和NC組細胞0.16mmol/L棕櫚酸處理24小時后,油紅O染色(圖4A)發(fā)現(xiàn)CD36RNAi組細胞內(nèi)脂滴明顯少于NC組,與細胞內(nèi)FFA定量測定結(jié)果相符[NC組(240.17±21.12)ng/mg,CD36RNAi組(98.38±14.18)ng/mg,P<0.05,n=4],顯微鏡下動態(tài)觀察也證實CD36RNAi組細胞對脂肪酸的攝入速度明顯慢于NC組細胞(圖4B)。1311第37卷第13期2015年7月15日第三軍醫(yī)大學學報JThirdMilMedUnivVol.37,No.13Jul.152015

HepG2細胞,內(nèi)脂


A:RNA干擾后HepG2細胞的CD36蛋白表達;B:RNA干擾后HepG2細胞的油紅O染色(×400);C:RNA干擾后HepG2細胞對熒光標記FFA的動態(tài)攝取攝像(×200)圖4抑制CD36表達對HepG2細胞內(nèi)脂質(zhì)積聚的影響3討論NAFLD是一組無過量飲酒史,又除外其他肝病的以肝細胞內(nèi)中性脂肪(主要是甘油三酯和脂肪酸)過度堆積為主要特征的臨床病理綜合征,包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎和肝硬化,后者可發(fā)展為肝癌[10-11]。幾乎所有NAFLD患者的血清游離脂肪酸含量較正常人群有不同程度的升高[12],而且NAFLD患者肝內(nèi)的脂質(zhì)約有60%都來源于外周,因此血循環(huán)中的脂肪酸異常轉(zhuǎn)運至肝細胞內(nèi),是導致肝臟脂質(zhì)異常積聚的重要原因[13]。CD36是具有多種功能的膜蛋白,如介導長鏈脂肪酸和氧化低密度脂蛋白的跨膜轉(zhuǎn)運,黏附多種生物大分子并通過胞內(nèi)信號傳導引發(fā)相應的炎癥、噬菌、內(nèi)吞功能等[14]。既往研究提示CD36與NAFLD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān):NAFLD患者的肝臟CD36表達增加,且CD36的表達量與肝臟脂肪變性程度呈正相關(guān)[15];而改善小鼠的肝內(nèi)脂質(zhì)積聚后,其肝臟的CD36表達也相應地降低[16]。但是,CD36參與NAFLD發(fā)生的具體機制尚不清楚。本研究表明棕櫚酸可以明顯上調(diào)HepG2細胞中CD36蛋白的表達。蛋白的表達受到多因素的復雜調(diào)控,其中,基因轉(zhuǎn)錄水平及蛋白翻譯水平的調(diào)節(jié)至關(guān)重要。因此,我們首先構(gòu)建了人CD36啟動子的表達質(zhì)粒,將其轉(zhuǎn)染HepG2細胞,測定CD36啟動子活性,同時應用熒光定量PCR測定細胞CD36的mRNA表達。結(jié)果表明:棕櫚酸對CD36的轉(zhuǎn)錄有明顯促進作用。進一步,我們應用多聚核糖體分析觀察了棕櫚酸對CD36蛋白翻譯的影響。核糖體是生物體蛋白質(zhì)合成的場所,mRNA與核糖體結(jié)合后啟動蛋白翻譯,與寡核糖體結(jié)合

【參考文獻】:
期刊論文
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本文編號:2910984

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