棕櫚酸上調(diào)FAT/CD36表達致HepG2細胞脂質(zhì)積聚的機制研究
發(fā)布時間：2020-12-11 18:01
目的觀察脂肪酸轉(zhuǎn)位酶FAT/CD36在棕櫚酸誘導的HepG2細胞內(nèi)脂質(zhì)積聚中的作用,并探討其分子機制。方法 HepG2細胞分對照組和棕櫚酸組,用Western blot、雙熒光素酶報告基因、熒光定量PCR、多聚核糖體分析檢測棕櫚酸對CD36表達、啟動子活性和蛋白翻譯效率的影響;油紅O染色和FFA定量測定反映細胞內(nèi)脂質(zhì)含量;熒光顯微鏡實時觀察細胞對FFA的動態(tài)攝入。然后將小干擾RNA轉(zhuǎn)染到HepG2細胞,構(gòu)建低表達CD36的HepG2細胞和陰性對照HepG2。用油紅O染色,FFA定量和熒光顯微鏡觀測棕櫚酸負荷的轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)脂質(zhì)積聚和FFA攝取。結(jié)果棕櫚酸能促進HepG2細胞CD36的表達,增強其啟動子活性,增加蛋白翻譯效率;棕櫚酸組細胞內(nèi)脂滴增多,FFA含量(240.17±19.83)ng/mg明顯高于對照組(144.60±53.52)ng/mg(P<0.05),脂肪酸攝取速度也明顯快于對照組;低表達CD36的HepG2細胞中CD36的mRNA和蛋白含量僅為陰性對照細胞的58%和50%。低表達CD36的HepG2細胞內(nèi)脂滴明顯少于陰性對照,FFA水平(98.38±14.18)ng/m...
【文章來源】：第三軍醫(yī)大學學報. 2015年13期 第1308-1313頁 北大核心
【文章頁數(shù)】：6 頁
【部分圖文】：
Westernblot檢測棕櫚酸對HepG2細胞CD36蛋白
高密度圖2CD36啟動子載體的構(gòu)建及棕櫚酸對CD36翻譯效率的影響2．3棕櫚酸對HepG2細胞內(nèi)脂質(zhì)積聚的影響普通HepG2細胞用0、0．16mmol/L棕櫚酸處理24h后，正置顯微鏡觀察油紅O染色結(jié)果發(fā)現(xiàn):與對照組(Control)相比，棕櫚酸組(PA)的HepG2細胞內(nèi)橘紅色脂滴增加;同時用酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測HepG2細胞內(nèi)FFA含量發(fā)現(xiàn)棕櫚酸處理組(240．17±19．83)ng/mg較對照組(144．60±53．52)ng/mg明顯升高(P＜0．05，n=4)，結(jié)果與油紅O染色結(jié)果一致(圖3A)。在顯微鏡下動態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)棕櫚酸處理組的細胞對FL-C16的攝取速率較對照組加快(圖3B)。A:HepG2細胞油紅O染色及細胞內(nèi)FFA定量(×400);B:HepG2細胞對熒光標記FFA的動態(tài)攝取攝像(×200)圖3棕櫚酸對HepG2細胞內(nèi)脂質(zhì)積聚的影響2．4抑制CD36表達對HepG2細胞CD36表達及細胞內(nèi)脂質(zhì)積聚的影響我們將CD36-siＲNA和NC-siＲNA瞬時轉(zhuǎn)入HepG2細胞成功構(gòu)建了低表達CD36的HepG2細胞(CD36-siＲNA-HepG2，CD36ＲNAi)和陰性對照HepG2(NC-siＲNA-HepG2，NC)。CD36ＲNAi的HepG2中CD36mＲNA與蛋白分別為NC組的(0．58±0．08)(P＜0．05，n=6)，(0．50±0．10)(P＜0．05，n=3)。給予CD36ＲNAi和NC組細胞0．16mmol/L棕櫚酸處理24小時后，油紅O染色(圖4A)發(fā)現(xiàn)CD36ＲNAi組細胞內(nèi)脂滴明顯少于NC組，與細胞內(nèi)FFA定量測定結(jié)果相符［NC組(240．17±21．12)ng/mg，CD36ＲNAi組(98．38±14．18)ng/mg，P＜0．05，n=4］，顯微鏡下動態(tài)觀察也證實CD36ＲNAi組細胞對脂肪酸的攝入速度明顯慢于NC組細胞(圖4B)。1311第37卷第13期2015年7月15日第三軍醫(yī)大學學報JThirdMilMedUnivVol．37，No．13Jul．152015
A:ＲNA干擾后HepG2細胞的CD36蛋白表達;B:ＲNA干擾后HepG2細胞的油紅O染色(×400);C:ＲNA干擾后HepG2細胞對熒光標記FFA的動態(tài)攝取攝像(×200)圖4抑制CD36表達對HepG2細胞內(nèi)脂質(zhì)積聚的影響3討論NAFLD是一組無過量飲酒史，又除外其他肝病的以肝細胞內(nèi)中性脂肪(主要是甘油三酯和脂肪酸)過度堆積為主要特征的臨床病理綜合征，包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎和肝硬化，后者可發(fā)展為肝癌［10－11］。幾乎所有NAFLD患者的血清游離脂肪酸含量較正常人群有不同程度的升高［12］，而且NAFLD患者肝內(nèi)的脂質(zhì)約有60%都來源于外周，因此血循環(huán)中的脂肪酸異常轉(zhuǎn)運至肝細胞內(nèi)，是導致肝臟脂質(zhì)異常積聚的重要原因［13］。CD36是具有多種功能的膜蛋白，如介導長鏈脂肪酸和氧化低密度脂蛋白的跨膜轉(zhuǎn)運，黏附多種生物大分子并通過胞內(nèi)信號傳導引發(fā)相應的炎癥、噬菌、內(nèi)吞功能等［14］。既往研究提示CD36與NAFLD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān):NAFLD患者的肝臟CD36表達增加，且CD36的表達量與肝臟脂肪變性程度呈正相關(guān)［15］;而改善小鼠的肝內(nèi)脂質(zhì)積聚后，其肝臟的CD36表達也相應地降低［16］。但是，CD36參與NAFLD發(fā)生的具體機制尚不清楚。本研究表明棕櫚酸可以明顯上調(diào)HepG2細胞中CD36蛋白的表達。蛋白的表達受到多因素的復雜調(diào)控，其中，基因轉(zhuǎn)錄水平及蛋白翻譯水平的調(diào)節(jié)至關(guān)重要。因此，我們首先構(gòu)建了人CD36啟動子的表達質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染HepG2細胞，測定CD36啟動子活性，同時應用熒光定量PCＲ測定細胞CD36的mＲNA表達。結(jié)果表明:棕櫚酸對CD36的轉(zhuǎn)錄有明顯促進作用。進一步，我們應用多聚核糖體分析觀察了棕櫚酸對CD36蛋白翻譯的影響。核糖體是生物體蛋白質(zhì)合成的場所，mＲNA與核糖體結(jié)合后啟動蛋白翻譯，與寡核糖體結(jié)合
【參考文獻】：
期刊論文
[1]Circulating microRNAs in patients with non-alcoholic fatty liver disease[J]. Serkan Dogan,Gokmen Zararsiz,Sebnem Gursoy,Kadri Guven,Omer Ozbakir,Munis Dundar,Mehmet Yucesoy. World Journal of Hepatology. 2014(08)
[2]TNF-α對HepG2細胞LXRα介導的膽固醇外流的影響及其分子機制[J]. 仝莎,陳曜,趙蕾,黃愛龍,阮雄中,陳壓西. 中國病理生理雜志. 2013(02)
[3]非酒精性脂肪性肝炎患者血清游離脂肪酸的檢測及其臨床意義[J]. 李紅山,朱德東,李德周. 中國衛(wèi)生檢驗雜志. 2013(01)
[4]非酒精性脂肪性肝病兔脂肪肝程度與肝組織硫化氫濃度的關(guān)系[J]. 譚華炳,朱德文,謝杏榕,李芳,胡波,李金科. 第三軍醫(yī)大學學報. 2010(22)
[5]炎癥應激加重CD36基因敲除小鼠胰島素抵抗[J]. 陳顯,柳青,雷寒,劉宏. 第三軍醫(yī)大學學報. 2010(09)
[6]非酒精性脂肪肝患者血漿FGF21水平及與肥胖、胰島素抵抗關(guān)系研究[J]. 周婷婷,秦波,鄭天鵬,朱其榮,劉漢屈. 第三軍醫(yī)大學學報. 2010(03)
本文編號：2910984
【文章來源】：第三軍醫(yī)大學學報. 2015年13期 第1308-1313頁 北大核心
【文章頁數(shù)】：6 頁
【部分圖文】：
Westernblot檢測棕櫚酸對HepG2細胞CD36蛋白
高密度圖2CD36啟動子載體的構(gòu)建及棕櫚酸對CD36翻譯效率的影響2．3棕櫚酸對HepG2細胞內(nèi)脂質(zhì)積聚的影響普通HepG2細胞用0、0．16mmol/L棕櫚酸處理24h后，正置顯微鏡觀察油紅O染色結(jié)果發(fā)現(xiàn):與對照組(Control)相比，棕櫚酸組(PA)的HepG2細胞內(nèi)橘紅色脂滴增加;同時用酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測HepG2細胞內(nèi)FFA含量發(fā)現(xiàn)棕櫚酸處理組(240．17±19．83)ng/mg較對照組(144．60±53．52)ng/mg明顯升高(P＜0．05，n=4)，結(jié)果與油紅O染色結(jié)果一致(圖3A)。在顯微鏡下動態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)棕櫚酸處理組的細胞對FL-C16的攝取速率較對照組加快(圖3B)。A:HepG2細胞油紅O染色及細胞內(nèi)FFA定量(×400);B:HepG2細胞對熒光標記FFA的動態(tài)攝取攝像(×200)圖3棕櫚酸對HepG2細胞內(nèi)脂質(zhì)積聚的影響2．4抑制CD36表達對HepG2細胞CD36表達及細胞內(nèi)脂質(zhì)積聚的影響我們將CD36-siＲNA和NC-siＲNA瞬時轉(zhuǎn)入HepG2細胞成功構(gòu)建了低表達CD36的HepG2細胞(CD36-siＲNA-HepG2，CD36ＲNAi)和陰性對照HepG2(NC-siＲNA-HepG2，NC)。CD36ＲNAi的HepG2中CD36mＲNA與蛋白分別為NC組的(0．58±0．08)(P＜0．05，n=6)，(0．50±0．10)(P＜0．05，n=3)。給予CD36ＲNAi和NC組細胞0．16mmol/L棕櫚酸處理24小時后，油紅O染色(圖4A)發(fā)現(xiàn)CD36ＲNAi組細胞內(nèi)脂滴明顯少于NC組，與細胞內(nèi)FFA定量測定結(jié)果相符［NC組(240．17±21．12)ng/mg，CD36ＲNAi組(98．38±14．18)ng/mg，P＜0．05，n=4］，顯微鏡下動態(tài)觀察也證實CD36ＲNAi組細胞對脂肪酸的攝入速度明顯慢于NC組細胞(圖4B)。1311第37卷第13期2015年7月15日第三軍醫(yī)大學學報JThirdMilMedUnivVol．37，No．13Jul．152015
A:ＲNA干擾后HepG2細胞的CD36蛋白表達;B:ＲNA干擾后HepG2細胞的油紅O染色(×400);C:ＲNA干擾后HepG2細胞對熒光標記FFA的動態(tài)攝取攝像(×200)圖4抑制CD36表達對HepG2細胞內(nèi)脂質(zhì)積聚的影響3討論NAFLD是一組無過量飲酒史，又除外其他肝病的以肝細胞內(nèi)中性脂肪(主要是甘油三酯和脂肪酸)過度堆積為主要特征的臨床病理綜合征，包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎和肝硬化，后者可發(fā)展為肝癌［10－11］。幾乎所有NAFLD患者的血清游離脂肪酸含量較正常人群有不同程度的升高［12］，而且NAFLD患者肝內(nèi)的脂質(zhì)約有60%都來源于外周，因此血循環(huán)中的脂肪酸異常轉(zhuǎn)運至肝細胞內(nèi)，是導致肝臟脂質(zhì)異常積聚的重要原因［13］。CD36是具有多種功能的膜蛋白，如介導長鏈脂肪酸和氧化低密度脂蛋白的跨膜轉(zhuǎn)運，黏附多種生物大分子并通過胞內(nèi)信號傳導引發(fā)相應的炎癥、噬菌、內(nèi)吞功能等［14］。既往研究提示CD36與NAFLD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān):NAFLD患者的肝臟CD36表達增加，且CD36的表達量與肝臟脂肪變性程度呈正相關(guān)［15］;而改善小鼠的肝內(nèi)脂質(zhì)積聚后，其肝臟的CD36表達也相應地降低［16］。但是，CD36參與NAFLD發(fā)生的具體機制尚不清楚。本研究表明棕櫚酸可以明顯上調(diào)HepG2細胞中CD36蛋白的表達。蛋白的表達受到多因素的復雜調(diào)控，其中，基因轉(zhuǎn)錄水平及蛋白翻譯水平的調(diào)節(jié)至關(guān)重要。因此，我們首先構(gòu)建了人CD36啟動子的表達質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染HepG2細胞，測定CD36啟動子活性，同時應用熒光定量PCＲ測定細胞CD36的mＲNA表達。結(jié)果表明:棕櫚酸對CD36的轉(zhuǎn)錄有明顯促進作用。進一步，我們應用多聚核糖體分析觀察了棕櫚酸對CD36蛋白翻譯的影響。核糖體是生物體蛋白質(zhì)合成的場所，mＲNA與核糖體結(jié)合后啟動蛋白翻譯，與寡核糖體結(jié)合
【參考文獻】：
期刊論文
[1]Circulating microRNAs in patients with non-alcoholic fatty liver disease[J]. Serkan Dogan,Gokmen Zararsiz,Sebnem Gursoy,Kadri Guven,Omer Ozbakir,Munis Dundar,Mehmet Yucesoy. World Journal of Hepatology. 2014(08)
[2]TNF-α對HepG2細胞LXRα介導的膽固醇外流的影響及其分子機制[J]. 仝莎,陳曜,趙蕾,黃愛龍,阮雄中,陳壓西. 中國病理生理雜志. 2013(02)
[3]非酒精性脂肪性肝炎患者血清游離脂肪酸的檢測及其臨床意義[J]. 李紅山,朱德東,李德周. 中國衛(wèi)生檢驗雜志. 2013(01)
[4]非酒精性脂肪性肝病兔脂肪肝程度與肝組織硫化氫濃度的關(guān)系[J]. 譚華炳,朱德文,謝杏榕,李芳,胡波,李金科. 第三軍醫(yī)大學學報. 2010(22)
[5]炎癥應激加重CD36基因敲除小鼠胰島素抵抗[J]. 陳顯,柳青,雷寒,劉宏. 第三軍醫(yī)大學學報. 2010(09)
[6]非酒精性脂肪肝患者血漿FGF21水平及與肥胖、胰島素抵抗關(guān)系研究[J]. 周婷婷,秦波,鄭天鵬,朱其榮,劉漢屈. 第三軍醫(yī)大學學報. 2010(03)
本文編號：2910984
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