【摘要】：目的:HBV的感染一直是困擾人類的一個問題,現有的手段并不能有效地控制其進展,而近年來對RNA干擾的研究證明其在抗病毒方面也有著巨大的潛力。本實驗擬評估長的反義RNA干擾片段在培養(yǎng)細胞株中對HBV復制的抑制效應。 方法:(1)將HBV基因組中S編碼基因的全部核苷酸序列插入至pTARGET載體中,構建重組質粒HBS2(反向插入序列)和HBS4(正向插入序列),并用這兩種質粒轉染HepG2.2.15細胞。(2)實驗分為HBS2組、HBS4組、干擾素組、聚肌胞組和對照組。(3)ELISA法檢測各組細胞上清中病毒抗原表達水平。(4)real time PCR法檢測各組細胞內和分泌入培養(yǎng)基的HBV DNA水平及細胞內的HBV cccDNA水平。(5)real time RT-PCR檢測各組細胞內β-干擾素mRNA水平。(6)Cellular DNA Fragmentation ELISA測定各組細胞的凋亡率。 結果:(1)PCR及測序結果顯示HBS2和HBS4質粒構建成功。(2)ELISA結果顯示HBS2組、干擾素組、聚肌胞組細胞上清中HBsAg和HBeAg的水平較對照組降低(P0.05),HBS4組HBsAg水平較對照組升高(P0.05),HBeAg水平無變化(P0.05)。(3)real time PCR結果顯示HBS2組、干擾素組、聚肌胞組細胞上清中HBV DNA水平和細胞內HBV DNA、HBV cccDNA水平較對照組降低(P0.05),HBS4組則均與對照組無差異(P0.05)。(4)real time RT-PCR結果顯示HBS2組、聚肌胞組細胞內β-干擾素mRNA水平較對照組升高(P0.05),HBS4組與對照組無差異(P0.05)。(5)Cellular DNA Fragmentation ELISA結果顯示HBS2組、干擾素組和聚肌胞組細胞凋亡率較對照組升高(P0.05),HBS4組與對照組無差異(P0.05)。 結論:長片段反義RNA能抑制HepG2.2.15細胞中HBV基因的表達和病毒復制,且能誘導HepG2.2.15細胞的凋亡。
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R512.62
【圖文】：

12000rpm 離心 1min，棄去 溶液 W，12000rpm 離心 1min，棄心 3min，以徹底去除純化柱中殘柱置于新的離心管中，向純化柱中 2min。12000rpm 離心 1min。測濃A 為模板，PCR 擴增 S 基因的編碼，重組質粒經過 PCR 擴增后得到陽序后得到重組質粒 HBS2 和 HBS S 抗原。質粒電泳圖見圖 1-1。1 2 3 4
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本文編號：2894122