發(fā)布時(shí)間：2020-11-20 06:53

　　 研究背景:肝損傷是臨床常見疾病,盡管我們?cè)谶^(guò)去幾十年中對(duì)肝損傷的機(jī)制研究取得了長(zhǎng)足進(jìn)步,但是目前除了對(duì)原發(fā)病的治療是防治肝損傷最為有效的手段外,臨床上仍缺乏有效逆轉(zhuǎn)肝損傷的特異藥物。近些年來(lái)從中藥提取物中發(fā)現(xiàn)了一些具有肝保護(hù)效應(yīng)的藥物,但這些藥物的作用靶點(diǎn)與機(jī)制仍不明確,其臨床療效也不確切。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)芳香烴受體(AHR)在調(diào)控肝毒性反應(yīng)和疾病耐受中發(fā)揮重要作用。酮康唑(KCZ)是AHR激動(dòng)劑,具有保肝和傷肝的雙重效應(yīng);葛根素(PUE)同樣具有保肝和傷肝的雙重效應(yīng),但鮮有葛根素對(duì)AHR影響的文獻(xiàn)報(bào)道。脂多糖(LPS)和四氯化碳(CCl4)是經(jīng)典的肝毒劑;課題組在前期的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),葛根素預(yù)處理加重LPS誘導(dǎo)的急性肝損傷,而對(duì)CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷則沒有影響;酮康唑的預(yù)處理則對(duì)LPS和CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷都有保護(hù)效應(yīng)。因此,本文研究了葛根素和酮康唑?qū)�急性肝損傷的影響,并初步探索了葛根素對(duì)AHR的影響。目的:1、研究葛根素和酮康唑預(yù)處理對(duì)脂多糖誘導(dǎo)急性肝損傷的影響;2、研究葛根素對(duì)肝臟AHR的影響;3、研究酮康唑預(yù)處理對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝損傷的保護(hù)效應(yīng)及其機(jī)制。方法:1、葛根素和酮康唑?qū)χ�多糖誘導(dǎo)大鼠肝損傷的作用研究SD成年大鼠,隨機(jī)分為五組;(Ⅰ)空白組;(Ⅱ)模型組:尾靜脈注射5mg/kg的LPS;(Ⅲ)葛根素+模型組:200mg/kg的PUE連續(xù)灌胃三天,每天一次,末次灌胃8小時(shí)后尾靜脈注射5mg/kg的LPS;(Ⅳ)酮康唑+模型組:100mg/kg的KCZ連續(xù)灌胃三天,每天一次,末次灌胃8小時(shí)后尾靜脈注射5 mg/kg的LPS;(V)葛根素組:200mg/kg的PUE連續(xù)灌胃三天,每天一次。LPS注射12小時(shí)后,大鼠在0.3%的戊巴比妥(1.6mL/kg)麻醉下打開腹腔,通過(guò)腹主動(dòng)脈采血2mL,剪取一部分肝組織,分別凍存和用10%的中性福爾馬林固定。分離血清,用自動(dòng)生化分析儀立即檢測(cè)肝損傷相關(guān)酶AST、ALT、LDH的活性;用試劑盒檢測(cè)血清亞硝酸鹽的含量;用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定血清中活性氧(ROS)的濃度;用石蠟包埋、HE染色法檢測(cè)肝組織病理學(xué)改變;用ELISA檢測(cè)肝臟組織中炎性因子TNF α、IL-6的表達(dá)。2、葛根素對(duì)肝臟AHR的影響組織標(biāo)本來(lái)源于第一部分實(shí)驗(yàn)的空白組和葛根素組。用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肝臟組織AHR蛋白的表達(dá);用熒光定量PCR(qPCR)法檢測(cè)肝臟組織AHR、CYP1A1、UGT1A1和TIPARP基因的表達(dá);用Western blot(WB)法檢肝臟組織ER α的表達(dá);用放射免疫法測(cè)定大鼠血清雌二醇濃度。3、酮康唑?qū)λ穆然�碳誘導(dǎo)的大鼠肝損傷的作用研究SD大鼠,隨機(jī)分為四組;(Ⅰ)空白組;(Ⅱ)模型組:腹腔注射50%(V/V)CC14-液體石蠟混合物(2ml/kg);(Ⅲ)酮康唑+模型組:100mg/kg的KCZ連續(xù)灌胃三天,每天一次,末次灌胃4小時(shí)后腹腔注射50%CCl4-液體石蠟混合物(2ml/kg);(Ⅳ)酮康唑組:1O0mg/kg的KCZ連續(xù)灌胃三天,每天一次。取動(dòng)物標(biāo)本12小時(shí)前大鼠禁食不禁水。注射CCl4混合物24小時(shí)后,腹腔注射0.3%的戊巴比妥(1.6mL/kg)麻醉大鼠,打開腹腔,通過(guò)腹主動(dòng)脈采血2mL后;剪取一部分肝組織,分別凍存和用10%的中性福爾馬林固定。分離血清,用自動(dòng)生化分析儀立即檢測(cè)轉(zhuǎn)氨酶AST和ALT的活性;用石蠟包埋、HE染色法檢測(cè)肝組織病理學(xué)改變;用試劑盒檢測(cè)GSH、GSSG和GSH/GSSG的比值;用ELISA檢測(cè)肝臟組織中炎性因子TNF α、IL-1 β、IL-6的濃度;用qPCR法檢測(cè)肝臟組織AHR、AHRR、CYP1A1、GSR、GST α、NQO1的基因表達(dá);用WB法檢測(cè)肝臟組織中HO-1、CYP2E1全蛋白和Nrf2、NF-κ B/p65細(xì)胞核蛋白的表達(dá)。結(jié)果:1、葛根素加重脂多糖的肝毒性,酮康唑減輕脂多糖的肝毒性。(1)死亡率:造模12小時(shí)內(nèi),模型組大鼠死亡1只,葛根素+模型組大鼠死亡2只,其余組無(wú)大鼠死亡,但組間死亡率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(2)病理切片:大鼠經(jīng)LPS刺激后,模型組肝組織呈片狀、橋接樣壞死,細(xì)胞核固縮甚至溶解,匯管區(qū)可見炎性免疫細(xì)胞浸潤(rùn)。葛根素+模型組中大鼠肝組織損傷更嚴(yán)重,酮康唑+模型組中肝組織也有片狀壞死和炎性細(xì)胞浸潤(rùn),但其損傷程度輕于模型組。未見葛根素組的肝損傷。(3)酶學(xué)指標(biāo):模型組血清中AST,ALT和LDH的活性明顯高于正常對(duì)照組(P0.01);葛根素+模型組的血清酶活性比模型組更高(P0.05),而酮康唑+模型組中的AST,ALT和LDH的活性低于模型組(P0.05或P0.01);與正常對(duì)照組相比,單獨(dú)葛根素沒有引起肝損傷相關(guān)酶活性的升高。(4)炎癥相關(guān)因子:亞硝酸鹽濃度檢測(cè)顯示,模型組明顯高于正常對(duì)照組(P0.01),葛根素+模型組比模型組更高(P0.05),而酮康唑+模型組中的亞硝酸鹽濃度低于模型組(P0.05)。模型組中血清ROS的水平明顯高于正常對(duì)照組(P0.01);葛根素+模型組大鼠血清ROS水平比模型組更高(P0.05),酮康唑+模型組中ROS的水平低于模型組(P0.05),葛根素組與空白對(duì)照組無(wú)差異。(5)炎性因子:模型組大鼠肝臟組織中TNF α和IL-6的含量明顯高于正常對(duì)照組(P0.01);葛根素+模型組肝臟組織中TNF α和IL-6的含量比模型組更高(P0.05);酮康唑+模型組中TNF α和IL-6的含量明顯低于模型組(P0.05),葛根素組與空白對(duì)照組無(wú)差異。2、葛根素對(duì)AHR及其相關(guān)蛋白和基因表達(dá)的影響。大鼠連續(xù)灌胃葛根素3天后,肝組織中AHR的表達(dá)明顯受到抑制,葛根素組免疫組化評(píng)分低于空白組(P0.05)。葛根素組肝臟AHR mRNA相對(duì)表達(dá)與空白組相比也受到明顯的抑制(P0.05)。相反,葛根素能明顯上調(diào)大鼠肝組織TiPARP mRNA的表達(dá)(P0.05)。連續(xù)服用3天的葛根素并沒有明顯影響大鼠血清雌二醇的含量,但是葛根素明顯上調(diào)肝組織ER α的相對(duì)表達(dá),與空白組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3、酮康唑預(yù)處理保護(hù)四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝損傷(1)病理切片:CCl4刺激大鼠24后,在顯微鏡的低倍視野下可見大面積的肝組織損傷,高倍視野下可見肝臟結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞,氣球樣空泡變性以及顯著的肝細(xì)胞膨脹;在酮康唑+模型組中,其肝組織損傷明顯輕于模型組;未見酮康唑組的肝損傷。(2)酶學(xué)指標(biāo):模型組血清中AST和ALT水平明顯升高(P0.01),酮康唑+模型組轉(zhuǎn)氨酶的活性低于模型組(P0.01),酮康唑組中ALT含量輕度的升高,但與空白組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),酮康唑?qū)Υ笫蟮腁ST含量沒有影響。(3)肝組織炎性因子和NF-κ B/p65蛋白:模型組肝組織中炎性因子含量顯著高于空白組(P0.01),而酮康唑+模型組中炎性因子含量低于模型組(p0.05)。模型組細(xì)胞核內(nèi)NF-κ B/p65的表達(dá)明顯高于空白對(duì)照組(p0.05),酮康唑+模型組中NF-κ B/p65的表達(dá)低于模型組(p0.05)。(4)抗氧化物:模型組中GSSG的含量明顯高于空白對(duì)照組(p0.01),酮康唑+模型組中GSSG含量明顯低于模型組(p0.05)。模型組中GSH/GSSG 比值明顯低于空白組(P0.01),酮康唑+模型組中GSH/GSSG 比值顯著高于模型組(p0.05)。模型組中GSR mRNA的表達(dá)與空白對(duì)照組無(wú)差異,酮康唑+模型組中GSR mRNA的表達(dá)高于模型組(P0.05),酮康唑組GSR mRNA的表達(dá)也高于空白組(p0.05)。模型組中NQO1 mRNA的表達(dá)與空白對(duì)照組無(wú)差異,酮康唑+模型組中NQO1 mRNA的表達(dá)明顯高于模型組(P0.05),酮康唑組中NQO1 mRNA的表達(dá)顯著高于空白組(p0.01)。模型組中GSTα mRNA的表達(dá)顯著低于空白組(p0.01),酮康唑+模型組中GSTα mRNA的表達(dá)明顯高于模型組(p0.01),酮康唑組GSTα mRNA的表達(dá)與空白對(duì)照組無(wú)差異。模型組中HO-1蛋白的表達(dá)與空白對(duì)照組無(wú)差異,酮康唑+模型組中HO-1蛋白表達(dá)明顯高于模型組(p0.05),酮康唑組中HO-1蛋白的表達(dá)與空白組無(wú)差異。模型組中Nrf2表達(dá)與空白對(duì)照組無(wú)差異,酮康唑+模型組中Nrf2的表達(dá)明顯高于模型組(P0.05),酮康唑組中Nrf2的表達(dá)明顯高于空白對(duì)照組(p0.05)。(5)AHR相關(guān)基因:模型組中AHR mRNA的表達(dá)明顯低于空白對(duì)照組(p0.05),酮康唑+模型組中AHR mRNA表達(dá)明顯高于模型組(p0.05),酮康唑組中AHR mRNA的表達(dá)顯著高于空白對(duì)照組(P0.01)。模型組中AHRR mRNA的表達(dá)與空白對(duì)照無(wú)差異,酮康唑+模型組中AHRR mRNA的表達(dá)明顯高于模型組(p0.05),酮康唑組中AHRR mRNA的表達(dá)明顯高于空白對(duì)照組(p0.05)。模型組中CYP1A1 mRNA的表達(dá)與空白對(duì)照組無(wú)差異,酮康唑+模型組中CYP1A1 mRNA的表達(dá)顯著高于模型組(p0.01),酮康唑組中CYP1A1 mRNA的表達(dá)顯著高于空白對(duì)照組(p0.01)。(6)CYP2E1:模型組中CYP2E1的表達(dá)明顯低于空白對(duì)照組(p0.05),酮康唑+模型組中CYP2E1蛋白表達(dá)與模型組無(wú)差異,與空白對(duì)照也無(wú)差異,酮康唑組中CYP2E1蛋白表達(dá)與空白對(duì)照組無(wú)差異。結(jié)論:1、在脂多糖誘導(dǎo)的急性肝損傷模型中,葛根素增加了肝臟的損害,促進(jìn)ROS和NO的釋放,增加肝臟TNF α和IL-6的濃度;表明葛根素有加重肝損傷的潛在風(fēng)險(xiǎn)。酮康唑減輕肝臟的損傷;表明適當(dāng)激活A(yù)HR可以增強(qiáng)肝臟對(duì)脂多糖的耐受。2、葛根素抑制大鼠肝組織AHR基因和蛋白的表達(dá),上調(diào)TIPARP mRNA的表達(dá),促進(jìn)肝組織ER α表達(dá);提示葛根素可能是肝臟AHR的抑制劑和ER α激動(dòng)劑。葛根素可能通過(guò)抑制AHR從而增加了肝臟對(duì)脂多糖的敏感性。3、酮康唑預(yù)處理減輕CCl4的肝毒性,這種保護(hù)機(jī)制可能是酮康唑預(yù)先激活了肝臟的AHR/Nrf2的信號(hào)通路,從而增強(qiáng)肝臟的抗炎和抗氧化能力;提示適當(dāng)激活A(yù)HR可以增強(qiáng)肝臟對(duì)CCl4的耐受。4、適度激活A(yù)HR有助于肝臟對(duì)毒性物質(zhì)的耐受,AHR的抑制增加了肝臟對(duì)脂多糖的敏感性。
【學(xué)位單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R575
【部分圖文】：

圖１－２、脂多糖造模１２小時(shí)后顯微鏡下觀察各組病理變化（Ｈ?＆?Ｅ，?１００?Ｘ）。??Ｆｉｇ．?１－２：?Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ?ｐｈｏｔｏｍｉｃｒｏｇｒａｐｈｓ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｌｉｖｅｒ?ｏｆ?ｒａｔｓ．??２６??

尾靜脈注射脂多糖１２小時(shí)后，大鼠血清的ＡＳＴ，?ＡＬＴ和ＬＤＨ的活性明??顯高于正常對(duì)照組（Ｐ＜０．０１）；和模型組相比，葛根素預(yù)處理的大鼠再受到脂??多糖的刺激后，其血清酶學(xué)水平比模型組更高（Ｐ＜〇．〇１）；酮康唑預(yù)處理組中??ＡＳＴ，?ＡＬＴ和ＬＤＨ的活性低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ｐ＜?０．０５）；與??正常對(duì)照組相比，單獨(dú)葛根素灌胃沒有引起肝損傷相關(guān)酶學(xué)的升高。結(jié)果見表??１－３?和圖?１－３。??表１－３、各組肝損傷相關(guān)酶學(xué)的血清活性（ｍｅａｎｓ?土?ＳＤ）??Ｔａｂｌｅ?１－３．?Ｓｅｒｕｍ?ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａＩ?ｍａｒｋｅｒｓ?ｒｅ?Ｉａｔｅｄ?ｔｏ?ｈｅｐａｔｏｃｅ?Ｉ?ＩｕＩａｒ?ｎｅｃｒｏｓ?ｉ?ｓ．??組別?數(shù)量?ＡＳＴ?（Ｕ／Ｌ）?ＡＬＴ?（Ｕ／Ｌ）?ＬＤＨ?（Ｕ／Ｌ）???對(duì)照?１２?８７．３±４．５?２３．７土?１．６?２Ｉ６±１４．２??模型?１１?５０４．５±６０．廣?５０３．?１±６３＿３＝?１１４６．５±９０．?dāng)U??葛根素＋模型?１０?９１４．２±１０１．８＿?９７３．?４±８１．?２＊?１８４８．?９±?１７８．?５＿??酮康唑＋模型?１２?２９７．６?士?２８’?２６９．４?土?３４．?１＊?６４０．６±４５．４＊＊??葛根素?１２?８５．９±３．９?２４．?７±１．?７?２１１．?９±１１．?７???注：各組方差差異大，采用Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ秩和檢驗(yàn)。＂Ｐ?＜?０．?０１：與對(duì)照組相比＜０．?０５，??＊＊Ｐ?＜?０．０５：與模型組相比。??１２００－１?＊?１２００－１?＊?－

廣州中醫(yī)藥大學(xué)２０１９屈博士學(xué)位論文Ｍ處理組中亞硝酸鹽的含Ｍ低于模型組，差異苻統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ｐ＜０對(duì)照組相比，單獨(dú)葛根素灌胃沒有引起亞硝酸鹽含量的升高。結(jié)果圖?１－４。??表１－４、各組血清亞硝酸鹽的含量（ｍｅａｎｓ?土?ＳＤ）??Ｔａｂｌｅ?１－４．?Ｌｅｖｅｌｓ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｓｅｒｕｍ?ｎｉｔｒｉｔｅ??數(shù)量?Ｎｉｔｒｉｔｅ?（?ｗＭ）??１２?１．３?±０．１３??１１?３０．６±２．８＝??＋模型?１０?４４．５±３．／Ｔ??＋模型?１２?２２．?９±２．礦???１２?０．９２?士?０．?１據(jù)符合正態(tài)分布，方差齊，用方差分析；＝Ｐ?＜?０．０１：與對(duì)照組相比，卞＜?０與模型組相比。??６０
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本文編號(hào)：2891114