發(fā)布時間：2020-11-20 05:32

　　 目的:探究microRNA-22在高脂環(huán)境下調(diào)控肝細(xì)胞衰老的作用及其分子機(jī)制,為非酒精性脂肪性肝病尋找有效干預(yù)靶點(diǎn)提供基礎(chǔ)。方法:(1)將BALB/c小鼠隨機(jī)分成2組:正常飲食組和高脂飲食組,每組10只。高脂飲食組用高脂飲食喂養(yǎng)誘導(dǎo)非酒精性脂肪性肝病。20W后,處理老鼠,稱量小鼠體重、肝重及附睪脂肪重量;生化試劑盒檢測各組小鼠肝甘油三酯的含量;蘇木紫-伊紅染色檢測肝脂肪變性程度;用半定量PCR檢測脂代謝相關(guān)基因Lxr、Acsl、Acc1、Chrebp以及P21的mRNA水平;(2)用衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色檢測組織肝細(xì)胞衰老情況;免疫熒光染色檢測P53、SIRT1的蛋白表達(dá),實(shí)時定量PCR技術(shù)檢測miR-22和Sirt1的相對表達(dá)量;流式微球技術(shù)檢測NAFLD小鼠血清中炎性因子IL2、IL4、IL6、IFNγ、TNF、IL17A和IL10的表達(dá)。(3)細(xì)胞學(xué)實(shí)驗,應(yīng)用MTT法確定棕櫚酸(PA)的最佳濃度;β-半乳糖苷酶染色檢測PA對BNL.CL2細(xì)胞衰老的作用;qPCR檢測PA處理BNL.CL2細(xì)胞后細(xì)胞周期及衰老相關(guān)基因P53、P21、Cdk2、Cdk6的相對表達(dá)量,以及miR-22、Sirt1和SASP炎性因子表達(dá)水平;免疫熒光染色檢測PA處理BNL.CL2細(xì)胞后SIRT1、P53、P21的蛋白表達(dá)情況(4)瞬時轉(zhuǎn)染miR-22 mimics到BNL.CL2肝細(xì)胞,檢測衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶,SIRT1、P53、P21、CDK2、CDK6以及SASP相關(guān)炎性因子的表達(dá),方法如前所述。(5)瞬時轉(zhuǎn)染miR-22 inhibitor至BNL.CL2肝細(xì)胞,6 h后,換PA處理84 h,檢測衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶、SIRT1、P53、P21、CDK2、CDK6以及SASP炎性因子的表達(dá),方法如前所述。結(jié)果:(1)高脂飲食的BALB/c小鼠表現(xiàn)為體重、肝重、附睪脂肪重量增加,肝甘油三酯含量上調(diào)等脂質(zhì)沉積的表現(xiàn);HE染色顯示肝脂肪變性,脂代謝異常的脂肪性肝病表現(xiàn)。(2)衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶及衰老相關(guān)蛋白增加;免疫熒光染色顯示在HFD組P53表達(dá)增加、SIRT1在核的表達(dá)下調(diào);qPCR顯示在HFD組miR-22表達(dá)增加和Sirt1表達(dá)降低;小鼠血清中炎性因子IL6、TNF的蛋白表達(dá)明顯增高。(3)MTT法及β-半乳糖苷酶染色檢測顯示PA濃度為100μM時,作用BNL.CL2細(xì)胞84 h后,藍(lán)染的陽性衰老細(xì)胞增多。實(shí)時定量PCR檢測PA處理BNL.CL2肝細(xì)胞后,衰老相關(guān)基因P53、P21表達(dá)增加,Cdk2、Cdk6及Sirt1的表達(dá)降低,miR-22及SASP炎性因子表達(dá)上調(diào);細(xì)胞免疫熒光染色顯示PA處理BNL.CL2肝細(xì)胞后,P53、P21在核表達(dá)增加,SIRT1在胞核表達(dá)減少,在胞漿表達(dá)增多。(4)BNL.CL2細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染miR-22 mimics后,SIRT1表達(dá)下調(diào)且在胞核的表達(dá)較少,同PA處理結(jié)果趨勢一致,衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶及衰老相關(guān)基因和蛋白增加,細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)下調(diào),SASP相關(guān)炎性因子上調(diào)。(5)BNL.CL2細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染miR-22 inhibitor后,與PA+microRNA inhibitor N.C處理組相比,PA+miR-22 inhibitor組衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶表達(dá)減少,SIRT1表達(dá)增加且在胞核表達(dá)增多,細(xì)胞周期相關(guān)基因在mRNA水平表達(dá)上調(diào),衰老相關(guān)基因和蛋白下調(diào)。結(jié)論:高脂環(huán)境可誘導(dǎo)肝細(xì)胞miR-22高表達(dá),進(jìn)而抑制SIRT1的活性,導(dǎo)致SASP上調(diào),誘導(dǎo)肝細(xì)胞衰老。MiR-22可通過靶向調(diào)控SIRT1/SASP誘導(dǎo)NAFLD發(fā)生發(fā)展,其可能成為NAFLD治療的潛在分子靶點(diǎn)。
【學(xué)位單位】：三峽大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R575
【部分圖文】：

圖 1 正常飲食組和高脂飲食組小鼠肝臟病理學(xué)表現(xiàn)注：HFD 肝出現(xiàn)明顯的脂滴，CD：正常飲食組，HFD：高脂飲食組，H&E 染色：FLD 小鼠肝脂代謝及炎性因子表達(dá)用逆轉(zhuǎn)錄 PCR 對小鼠高脂飲食組及正常飲食組小鼠肝組織中脂代謝相csl、Acc1、Chrebp 等進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示：與正常飲食組相比，Hhrebp 表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)意義外，Lxr、Acsl、Acc1、Chrebp 其他基因均有明時，在高脂飲食組中 P21 和 Il1α 表達(dá)均增高。（見圖 2）圖 2 NAFLD 小鼠肝組織中脂代謝基因及 P21、Il1α 的 mRNA 表達(dá)量

圖 1 正常飲食組和高脂飲食組小鼠肝臟病理學(xué)表現(xiàn)（注：HFD 肝出現(xiàn)明顯的脂滴，CD：正常飲食組，HFD：高脂飲食組，H&E 染色：200×）1.3NAFLD 小鼠肝脂代謝及炎性因子表達(dá)利用逆轉(zhuǎn)錄 PCR 對小鼠高脂飲食組及正常飲食組小鼠肝組織中脂代謝相關(guān)基因Lxr、Acsl、Acc1、Chrebp 等進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示：與正常飲食組相比，HFD 模型組除 Chrebp 表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)意義外，Lxr、Acsl、Acc1、Chrebp 其他基因均有明顯的變化。同時，在高脂飲食組中 P21 和 Il1α 表達(dá)均增高。（見圖 2）

22圖 3 形態(tài)學(xué)觀察肝細(xì)胞衰老表征A.HFD 組肝細(xì)胞核明顯增大，DAPI 染色：400×，B.HFD 組出現(xiàn)明顯藍(lán)染顆粒，達(dá)增加，CD：正常飲食組，HFD：高脂飲食組，衰老特異性 β-半乳糖苷酶染色：AFLD 小鼠肝中 P53 表達(dá)細(xì)胞衰老時 P53 蛋白表達(dá)增高，用石蠟切片行間接免疫熒光法檢測小鼠食組肝組織中 P53 蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示：高脂飲食組肝細(xì)胞核內(nèi) P53 的高于正常對照組（見圖 4）。
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3 張蕊;湯鋒;鄧琳;邢瑩瑩;奚濤;;microRNA-22真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在卵巢癌細(xì)胞系SKOV-3中的穩(wěn)定表達(dá)[J];藥物生物技術(shù);2012年03期

4 高四海;張鶴美;賀金獎;張增利;童建;李冰燕;;1,25-(OH)_2D_3抑制人卵巢癌細(xì)胞SKOV-3增殖與調(diào)控microRNA-22的表達(dá)有關(guān)[J];營養(yǎng)學(xué)報;2014年01期

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本文編號：2891024