發(fā)布時(shí)間：2020-11-15 12:58

　　 目的:對乙酰氨基酚(APAP)攝入過量是引起急性肝衰竭的重要原因。肝細(xì)胞損傷后,單核細(xì)胞浸潤到肝臟,參與炎癥反應(yīng);炎性單核細(xì)胞隨后轉(zhuǎn)化為修復(fù)型巨噬細(xì)胞,促進(jìn)損傷修復(fù)。目前調(diào)控單核巨噬細(xì)胞功能轉(zhuǎn)化的機(jī)制仍不清楚。前期研究發(fā)現(xiàn),中腦星形膠質(zhì)細(xì)胞來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(MANF)在小鼠髓系細(xì)胞中缺失,會延緩APAP誘導(dǎo)的肝臟損傷(AILI)修復(fù),降低損傷恢復(fù)期修復(fù)型巨噬細(xì)胞的比例和數(shù)量。我們推測,MANF通過調(diào)控肝臟單核巨噬細(xì)胞功能來促進(jìn)AILI修復(fù)。本課題使用髓系細(xì)胞特異性MANF敲除鼠,hrMANF,闡釋單核巨噬細(xì)胞來源的MANF促進(jìn)AILI修復(fù);通過流式分析,qPCR等揭示MANF調(diào)控單核巨噬由促炎型向修復(fù)型轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制,單核巨噬細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制的闡明,將為以MANF和單核巨噬細(xì)胞為靶點(diǎn)治療藥物性肝損傷提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:構(gòu)建髓系細(xì)胞特異性缺失MANF的基因缺陷小鼠MANF~(fl/fl)Lyz2-Cre-T(MYEL manf~(-/-))及肝細(xì)胞特異性缺失MANF的基因缺陷型小鼠MANF~(fl/fl)Alb-Cre-T(HEPA manf~(-/-));給小鼠腹腔注射APAP(300mg/kg)誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性APAP誘導(dǎo)肝損傷(AILI)模型;利用流式細(xì)胞術(shù)檢測MANF特異性敲除小鼠肝臟免疫細(xì)胞群體分布是否發(fā)生變化;通過檢測血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)含量及肝組織HE染色評價(jià)肝損傷嚴(yán)重程度;qPCR方法檢測AILI小鼠肝組織炎性細(xì)胞因子及趨化因子的表達(dá);增殖特異性抗體Ki67對肝臟粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞染色,檢測細(xì)胞增殖情況;分離小鼠外周血白細(xì)胞,檢測CCR2~+單核細(xì)胞的比例;AILI修復(fù)期通過尾靜脈注射外源補(bǔ)充人源重組MANF,檢測小鼠肝損傷情況。結(jié)果:MANF缺失不影響肝臟免疫細(xì)胞群體分布;MYEL manf~(-/-)鼠肝臟損傷恢復(fù)受阻;MYEL manf~(-/-)鼠肝臟炎癥程度高于C57BL/6對照鼠;MYEL manf~(-/-)鼠注射APAP后肝臟浸潤的單核細(xì)胞數(shù)量高于野生鼠,但損傷后期Ly6C~(low)修復(fù)型巨噬細(xì)胞比例顯著低于野生型鼠;MANF缺失后MYEL manf~(-/-)鼠肝臟單核/巨噬細(xì)胞增殖能力顯著增強(qiáng);MYEL manf~(-/-)鼠外周血CCR2~+單核細(xì)胞增高;hrMANF促進(jìn)肝損傷修復(fù)。結(jié)論:MANF可能是AILI中一個(gè)重要調(diào)節(jié)分子,它通過抑制單核細(xì)胞表達(dá)CCR2,調(diào)節(jié)單核細(xì)胞浸潤;并介導(dǎo)促炎性Ly6C~(hi)巨噬細(xì)胞向修復(fù)型Ly6C~(low)巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)換,促進(jìn)肝臟損傷修復(fù)。
【學(xué)位單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R575
【部分圖文】：

25圖 1 WT 鼠、HEPA manf-/-鼠及 MYEL manf-/-鼠肝臟淋巴細(xì)胞比例。igure1 .The proportion of liver lymphocytes in WT mice HEPA manf-/-and MYEL manf-/-mic

安徽醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文通過 WT 對照鼠，HEPAmanf-/-鼠和 MYELmanf-/-鼠的對比，我們發(fā)現(xiàn)在損修復(fù)期（48h，72h，96h）MYEL manf-/-鼠的血清中 ALT 水平較高，而 HEPAanf-/-鼠和 WT 對照鼠相比無顯著性差異。肝臟組織 H&E 染色也顯示在損傷修期， MYEL manf-/-鼠肝臟仍有大量的淋巴細(xì)胞浸潤和壞死肝細(xì)胞，而 WT 對鼠和 HEPAmanf-/-鼠肝臟組織已基本修復(fù)。結(jié)果表明肝細(xì)胞缺失 MANF 對ILI 過程中肝損傷及肝臟修復(fù)無影響，但是髓系細(xì)胞缺失 MANF 后影響了小鼠臟的修復(fù)能力。

圖 3. APAP 注射后 MYELmanf-/-鼠和 WT 鼠肝臟中相關(guān)基因的表達(dá)水平。Fig.3. Expression levels of genes related to liver injury in MYELmanf-/-mice and WT mice afterAPAP challenge.小鼠腹腔注射 APAP（300mg/kg）誘導(dǎo)急性肝損傷，于不同時(shí)間點(diǎn)（0h，12h，24h，48h，72h，96h）收集小鼠的肝組織，通過 RT-PCR 檢測肝臟中炎性細(xì)胞因子 TNF-α，IL-1β，NOS2，Ym-1，以及細(xì)胞因子 IL-10 和 CD86 的表達(dá)情況，結(jié)果如圖三所示。3.4 MYEL manf-/-鼠注射 APAP 后肝臟浸潤的單核細(xì)胞數(shù)量高于野生鼠，但損傷后期 Ly6Clow修復(fù)型巨噬細(xì)胞比例顯著低于野生型鼠在 APAP 誘導(dǎo)的肝損傷模型中，粒細(xì)胞首先浸潤至肝臟參與炎癥反應(yīng)，而巨噬細(xì)胞由于其異質(zhì)性，對小鼠的損傷及修復(fù)發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[23]。因此我們猜測 MYEL manf-/-鼠在 AILI 過程中肝損傷修復(fù)受阻且伴隨著炎癥加強(qiáng)是否與這
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本文編號：2884785