【摘要】：研究內(nèi)容與目的:本課題旨在探究CD24分子在四氯化碳(Carbon Tetrachloride,CCl4)所誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化發(fā)生的調(diào)節(jié)作用及其細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。本實驗的研究內(nèi)容主要分為以下四個部分:一、建立CCl4所誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型,觀察小鼠肝纖維化后CD24分子在肝組織中的變化;二、探究CD24分子對小鼠肝纖維化的調(diào)節(jié);三、檢測CD24分子在不同免疫細(xì)胞中的表達,觀察CD24分子對肝內(nèi)巨噬細(xì)胞的調(diào)節(jié);四、解析CD24分子對巨噬細(xì)胞亞型的調(diào)節(jié)及分子機制。研究方法和結(jié)果:本課題分為四個部分研究:第一部分建立CCl4所誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型,觀察CD24分子在肝臟組織中的變化,包括兩部分實驗:1.構(gòu)建小鼠肝纖維化的模型:小鼠腹腔注射CCl4六周,HE染色觀察小鼠肝組織損傷情況,血清學(xué)方法檢測ALT(谷丙轉(zhuǎn)氨酶)表達水平。Sirius Red染色檢測小鼠的肝臟組織中的膠原纖維沉積,Real-time PCR方法檢測肝組織中的α-SMA,Col1a1表達。結(jié)果顯示:小鼠腹腔注射CCl4六周后,HE染色中小鼠肝組織中的炎性細(xì)胞浸潤增多,ALT表達增高;Sirius Red染色發(fā)現(xiàn)膠原纖維在肝組織中增多;Real-time PCR方法檢測到肝臟組織中α-SMA,Col1a1表達升高。成功構(gòu)建了小鼠肝纖維化的模型。2.檢測肝纖維化小鼠的肝組織中CD24分子表達:Real-time PCR方法檢測肝纖維化小鼠肝組織中CD24分子的表達,Western Blot檢測在肝組織中α-SMA、CD24分子蛋白水平表達。結(jié)果顯示:在CCl4所誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型中,肝組織中CD24 mRNA表達水平明顯升高,同時,Western Blot檢測CD24分子也升高。因此,CCl4所誘導(dǎo)小鼠肝纖維化后,在肝組織中CD24分子表達升高。第二部分探究CD24分子對小鼠肝纖維化的調(diào)節(jié),包括兩部分實驗:1.肝組織病理學(xué)評估WT和CD24-/-小鼠肝纖維化的變化:野生型(WT)小鼠和CD24基因敲除小鼠(CD24-/-)注射CCl4后,HE染色和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)評估肝損傷情況;Sirius Red染色評估肝組織中的膠原纖維。結(jié)果顯示:HE染色觀察到:在CD24-/-小鼠的肝組織中,其炎性細(xì)胞的浸潤明顯多于WT小鼠,血清中ALT表達水平也明顯升高。Sirius Red染色結(jié)果顯示:CD24-/-小鼠肝組織中膠原纖維多于WT小鼠。因此,從肝組織病理學(xué)得出,野生型(WT)小鼠和CD24基因敲除小鼠(CD24-/-)同時腹腔注射CCl4后,CD24-/-小鼠肝損傷和肝纖維化程度更為嚴(yán)重。2.基因表達和蛋白水平評估WT和CD24-/-小鼠的肝纖維化:Real-time PCR方法檢測肝組織中α-SMA,Col1a1的表達;Western Blot檢測WT和CD24-/-小鼠肝組織中,α-SMA蛋白水平的變化。結(jié)果顯示:CD24-/-的肝纖維化小鼠中,Real-time PCR方法檢測到肝組織α-SMA、Col1a1肝纖維化指標(biāo)都明顯高于WT小鼠,同樣,Western Blot檢測α-SMA也高于WT小鼠。從基因表達和蛋白水平得出:CD24基因敲除后,CCl4處理的小鼠肝纖維化指標(biāo)都高于WT的肝纖維化小鼠。第三部分檢測CD24分子在不同免疫細(xì)胞中的表達,觀察CD24分子對肝內(nèi)巨噬細(xì)胞的調(diào)節(jié),包括三部分實驗:1.WT小鼠肝纖維化后,流式細(xì)胞術(shù)檢測不同免疫細(xì)胞上CD24分子的變化。結(jié)果顯示:WT小鼠肝纖維化后,相比其他免疫細(xì)胞,巨噬細(xì)胞表面的CD24分子升高明顯。2.流式細(xì)胞術(shù)檢測WT和CD24-/-肝纖維化小鼠肝內(nèi)巨噬細(xì)胞的變化。結(jié)果顯示:流式細(xì)胞術(shù)分析表明肝纖維化發(fā)生后,CD24-/-小鼠的巨噬細(xì)胞明顯多于WT小鼠。3.應(yīng)用注射氯氟松消耗掉小鼠的肝臟巨噬細(xì)胞后,評估小鼠的肝纖維化程度。結(jié)果顯示:小鼠肝臟內(nèi)巨噬細(xì)胞消耗后,Sirius Red染色發(fā)現(xiàn),小鼠肝臟內(nèi)膠原纖維減少;Real-time PCR檢測Col1a1 mRNA降低;說明:小鼠肝纖維化程度減弱。第四部分解析CD24分子對巨噬細(xì)胞亞型的調(diào)節(jié)及分子機制,包括兩部分實驗:1.檢測肝纖維化小鼠肝組織中TGF-β1的表達。結(jié)果顯示:Real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn)在CD24-/-小鼠肝組織中TGF-β1 mRNA的表達明顯高于WT小鼠。2.檢測TGF-β1在巨噬細(xì)胞不同亞型中的表達及分泌:LPS和IL-4分別刺激WT和CD24-/-小鼠的巨噬細(xì)胞,使之形成M1、M2型巨噬細(xì)胞后,應(yīng)用ELISA和Real-time PCR方法檢測TGF-β1的表達及分泌。結(jié)果顯示:ELISA檢測發(fā)現(xiàn)CD24-/-小鼠的M2型巨噬細(xì)胞上清中,TGF-β1的分泌量多于WT的M2型巨噬細(xì)胞上清,而在M1型巨噬細(xì)胞上清中無明顯變化。同樣,Real-time PCR檢測TGF-β1 m RNA表達得到了同樣的結(jié)果。結(jié)論:CD24分子在肝纖維化小鼠肝組織中表達升高,調(diào)節(jié)了CCl4所誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化,其機制可能是通過調(diào)節(jié)肝內(nèi)M2型巨噬細(xì)胞所分泌的促纖維化因子TGF-β1,進而改變肝星狀細(xì)胞(HSCs)的活性以減輕肝的纖維化。
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【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R575.2

【參考文獻】

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本文編號：2390979