目的：通過(guò)觀察不同濃度乙醇作用于大鼠H4-ⅡE細(xì)胞,探討乙醇對(duì)肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝及其相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。方法:1.細(xì)胞培養(yǎng)將一定量大鼠H4-ⅡE細(xì)胞移至潔凈培養(yǎng)瓶中,根據(jù)細(xì)胞密度加入適量DMEM培養(yǎng)液,于37℃,5% CO2培育箱中培養(yǎng)：2.MTT方法檢測(cè)細(xì)胞活性將梯度濃度乙醇作用于細(xì)胞,作用時(shí)間分別設(shè)立為24 h、48 h、72 h,選擇其中對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)活性有一定影響的乙醇濃度作為實(shí)驗(yàn)濃度(0.2、0,4、0.6 mmol/l),實(shí)驗(yàn)時(shí)間設(shè)為24 h；3.細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察HE染色、油紅O染色、AnnexinV-FITC染色、免疫組化染色倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；4.免疫組化方法觀察各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein Kinase, AMPK)及過(guò)氧化物酶體增值物激活受體(Peroxisome Proliferator-activated Receptora, PPARa)的表達(dá)情況：5.Elisa方法檢測(cè)梯度濃度乙醇作用細(xì)胞12 h、24 h、48 h、72 h后,各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)上清中AMPK,乙酰輔酶A羧化酶(Acectyl-CoA-Carboxylase ,ACC),游離脂肪酸(Free fatty acid, FFA)以及肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-1 (carnitine palmitoyl transferasel, CPT-1)的分泌量情況；6. Western blotting檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)P-AMPK、PPAR-α、P-ACC、CPT-I的表達(dá),7.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果：1.MTT一定濃度的乙醇作用H4-ⅡE細(xì)胞后,對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯的抑制作用,且與作用時(shí)間以及乙醇的濃度密切相關(guān)(P0.05)；2.細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好,各乙醇實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞呈現(xiàn)出不同程度的凋亡形態(tài)學(xué)變化；3.免疫組化染色結(jié)果同對(duì)照組相比較,0.2,0.4、0.6 mol/1實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞AMPK、 PPARa的陽(yáng)性表達(dá)率明顯下降；0.6 mol/1乙醇實(shí)驗(yàn)組AMPK、PPAR-a陽(yáng)性表達(dá)率低于0.4 mol/1組,0.4 mol/1實(shí)驗(yàn)組AMPK、 PPAR-a陽(yáng)性表達(dá)率低于0.2 mol/1組(P0.05)。4.Elisa結(jié)果在一定的乙醇濃度范圍及作用時(shí)間內(nèi),乙醇可增加H4-ⅡE細(xì)胞培養(yǎng)上清中ACC,FFA、AMPK及CPT-Ⅰ的泄漏量(P0.05)；其中當(dāng)乙醇濃度在0.1-1.4 mol/1范圍內(nèi)時(shí),各乙醇實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞AMPK及CPT-I的泄漏量隨著乙醇的濃度增長(zhǎng)作用時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加；而1.6 mol/1組AMPK、CPT-I泄漏量(作用時(shí)間48 h、72 h)低于1.4 mol/1組,呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；5.Western blotting結(jié)果顯示同對(duì)照組相比較,各乙醇實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞P-AMPK、 P-ACC、PPARa及CPT-Ⅰ蛋白的表達(dá)量明顯下降；隨著乙醇濃度的增長(zhǎng),各組細(xì)胞P-AMPK、P-ACC. PPARa及CPT-Ⅰ蛋白的表達(dá)量逐漸下降(0.6 mol/1組0.4mol/1組0.2 mol/1組)(P0.05)。6.流式細(xì)胞術(shù)①同對(duì)照組相比較,各乙醇實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的凋亡率明顯增加；且0.6mol/1組凋亡率0.4mol/1組0.2mol/1組(P0.05)；②同對(duì)照組相比較,各乙醇實(shí)驗(yàn)組正常活細(xì)胞數(shù)明顯減少,且0.6mol/1組0.4 mol/1組0.2mol/1組(P0.05)；⑧同對(duì)照組相比較,各乙醇實(shí)驗(yàn)組凋亡細(xì)胞及死亡的細(xì)胞數(shù)顯著增多,且0.6mol/1組0.4 mol/1組0.2 mol/1組(P0.05)。結(jié)論：1.乙醇對(duì)肝細(xì)胞的生長(zhǎng)有抑制作用,并可誘導(dǎo)肝細(xì)胞的凋亡。2.乙醇可引起肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝紊亂,增加脂肪酸含量并抑制其氧化,其機(jī)制可能與AMPK等相關(guān)信號(hào)途徑有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：延邊大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R575
文章目錄
摘要
Abstract
中英文縮略詞表
第一章 引言
第二章 材料和方法
2.1 實(shí)驗(yàn)材料
2.1.1 細(xì)胞株
2.1.2 主要試劑及藥物
2.1.3 主要儀器
2.2 實(shí)驗(yàn)方法
2.2.1 H4-ⅡE細(xì)胞的培養(yǎng)
2.2.2 MTT法
2.2.3 H4-ⅡE細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察
2.2.4 Elisa方法檢測(cè)AMPK、FFA、ACC、CPT-Ⅰ溢出量
2.2.5 流式細(xì)胞術(shù)--H4-ⅡE細(xì)胞凋亡率的檢測(cè)
2.2.6 Western方法--觀察各實(shí)驗(yàn)組相關(guān)蛋白表達(dá)情況
2.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
第三章 結(jié)果
3.1 MTT結(jié)果
3.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察
3.2.1 倒置顯微鏡下觀察
3.2.2 HE染色
3.2.3 免疫組化組化染色
3.2.4 AnnexinV-FITC/PI染色結(jié)果
3.2.5 油紅0染色
3.3 流式細(xì)胞術(shù)--細(xì)胞凋亡率
3.4 Elisa結(jié)果
3.5 免疫組化結(jié)果
3.6 western blot檢測(cè)各組蛋白的表達(dá)
第四章 討論
4.1 乙醇抑制H4-ⅡE細(xì)胞的增殖
4.2 乙醇誘導(dǎo)H4-ⅡE細(xì)胞凋亡
4.2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察
4.2.2 流式細(xì)胞術(shù)（FCN）測(cè)各組細(xì)胞凋亡率
4.3 乙醇與脂質(zhì)代謝
4.3.1 油紅0鑒定脂質(zhì)沉積
4.3.2 乙醇可降低胞內(nèi)AMPK的表達(dá)
4.3.3 乙醇降低細(xì)胞內(nèi)PPAR α表達(dá)
4.3.4 乙醇減少CPT-I表達(dá)量,降低ACC磷酸化水平
第五章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
綜述
參考文獻(xiàn)
【相似文獻(xiàn)】
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本文編號(hào)：
2387616
