發(fā)布時間：2018-12-18 00:17

【摘要】：急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是臨床常見的危重疾病,起病急驟,病情發(fā)展迅速,病死率較高。除了胰腺本身病變外,還可以引起胰腺外組織和器官的損傷,甚至誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合癥和多器官功能障礙綜合征而導(dǎo)致死亡。盡管在過去的幾十年里急性胰腺炎的研究取得明顯進展,但是其發(fā)病機制仍較復(fù)雜。隨著近幾年來細胞分子生物學(xué)等方面的深入研究,胰腺腺泡細胞損傷的細胞生物學(xué)機制取得較大進展,其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)引起廣泛關(guān)注。X-盒結(jié)合蛋白1(X-box binding protein 1,XBP1)是與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)折疊有關(guān)的蛋白質(zhì)。XBP1在調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)及維持成熟腺泡細胞生存力中起到直接重要作用,其表達上調(diào)常用于ERS的標(biāo)志。大量研究已表明XBP1與糖尿病、腫瘤、炎癥性疾病、病毒感染、心血管疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病等多種人類疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。但是目前XBP1與胰腺炎關(guān)系的研究較少,故本研究擬初步探討siRNA沉默XBP1對急性胰腺炎腺泡細胞TNF-α、IL-6的影響。目的:本研究通過雨蛙素或雨蛙素聯(lián)合脂多糖作用于沉默XBP1基因的AR42J細胞獲得不同程度的胰腺炎模型。并通過監(jiān)測細胞培養(yǎng)液中淀粉酶(amylase,AMY)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的水平,初步探討siRNA沉默XBP1對急性胰腺炎腺泡細胞TNF-α、IL-6的影響。方法:1獲得XBP1基因沉默的AR42J細胞:用熒光標(biāo)記的siRNA(FAM-siRNA)轉(zhuǎn)染細胞,通過熒光顯微鏡篩選出siRNA轉(zhuǎn)染的最適濃度。在與XBP1沉默相關(guān)的三條siRNA中,通過實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)篩選出沉默效果最佳的siRNA。2制造模型:將AR42J細胞隨機分為轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染組:用沉默效果最佳的siRNA轉(zhuǎn)染AR42J細胞,后將細胞分為三組:雨蛙素組(CAE組)、雨蛙素+脂多糖組(CAE+LPS組)、對照組(control組)。cae組給予10-7mol/l雨蛙素,cae+lps組組給予10-7mol/l雨蛙素+10mg/l脂多糖,control組給予等體積完全培養(yǎng)基。分別于4h、8h、24h三個時間點收集各組細胞上清液。未轉(zhuǎn)染組:將未轉(zhuǎn)染的ar42j細胞分為三組:cae組、cae+lps組、control組。干預(yù)方法同上。3實驗方法:采用rt-pcr觀察ar42j細胞中轉(zhuǎn)染效果。應(yīng)用淀粉酶試劑盒檢測細胞上清中淀粉酶(amylase,amy)水平,利用elisa(enzymelinkedimmunosorbentassay)方法檢測細胞培養(yǎng)上清中腫瘤壞死因子-α(tumornecrosisfactor-α,tnf-α)及白細胞介素-6(interleukin-6,il-6)水平。4統(tǒng)計學(xué)方法:應(yīng)用spss13.0軟件包進行統(tǒng)計學(xué)處理,p0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果:1用不同sirna轉(zhuǎn)染細胞,為篩選沉默效果最佳的sirna行熒光定量pcr檢測xbp1mrna表達,結(jié)果顯示:xbp1-303組、xbp1-684組、xbp1-808組與空白組比較xbp1mrna表達水平較低,有統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05),其中xbp1-303組xbp1mrna表達水平顯著下降。陰性對照組、lipo組與空白組比較xbp1mrna表達水平間無統(tǒng)計學(xué)差異。2細胞培養(yǎng)上清amy:未轉(zhuǎn)染組與轉(zhuǎn)染組兩組組內(nèi)比較:在各時間點,control組細胞上清amy水平較低且無顯著變化;與之相比,cae組及cae+lps組amy水平均顯著升高(p0.05),且隨時間延長而逐漸上升在8h達最高水平;與cae組相比,cae+lps組各時間點血清amy水平則明顯上升(p0.05)。兩組組間比較:除control組各時間點amy水平無統(tǒng)計學(xué)差異外,cae組及cae+lps組各時間點amy水平轉(zhuǎn)染組較未轉(zhuǎn)染組均明顯升高(p0.05)。3細胞培養(yǎng)上清tnf-α:未轉(zhuǎn)染組與轉(zhuǎn)染組兩組組內(nèi)比較:control組細胞上清tnf-α水平在各時間點均較低;cae組及cae+lps組分別與control組比較,各時間點tnf-α均顯著升高(p0.05),且隨時間延長而逐漸上升;cae+lps組與cae組相比,在各時間點血清tnf-α水平均明顯上升(p0.05)。兩組組間比較:在各時間點,control組tnf-α水平無統(tǒng)計學(xué)學(xué)差異,cae組及cae+lps組tnf-α水平轉(zhuǎn)染組較未轉(zhuǎn)染組均明顯升高(P0.05)。4細胞培養(yǎng)上清IL-6:未轉(zhuǎn)染組與轉(zhuǎn)染組兩組組內(nèi)比較:在各時間點,Control組細胞上清IL-6水平均無顯著變化,且較低;CAE組及CAE+LPS組各時間點IL-6水平均隨時間延長而逐漸上升,且較Control組顯著升高(P0.05);在各時間點與CAE組相比,CAE+LPS組細胞培養(yǎng)上清IL-6水平均明顯上升(P0.05)。兩組組間比較:Control組各時間點IL-6水平無顯著變化,CAE組及CAE+LPS組各時間點IL-6水平轉(zhuǎn)染組較未轉(zhuǎn)染組均明顯升高(P0.05)。結(jié)論:1應(yīng)用雨蛙素及雨蛙素聯(lián)合脂多糖可成功復(fù)制AP和SAP體外模型,為研究XBP1在急性胰腺炎炎癥反應(yīng)中的作用提供了條件。2在AP細胞模型中TNF-α、IL-6水平明顯增高,它們作為關(guān)鍵性的炎癥因子,在AP發(fā)生發(fā)展中起重要作用。3沉默XBP1后急性胰腺炎胰腺腺泡細胞產(chǎn)生AMY升高,同時伴隨TNF-α、IL-6水平明顯升高,表明XBP1參與了急性胰腺炎的發(fā)生,可能通過減少細胞因子TNF-α、IL-6的產(chǎn)生而發(fā)揮保護作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R576

【參考文獻】

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本文編號：2384991