發(fā)布時間：2018-05-30 11:50

  本文選題：谷丙轉氨酶 + 非酒精性脂肪肝　； 參考：《廣西醫(yī)科大學》2014年博士論文

【摘要】：第一章 第一部分 影響廣西防城港地區(qū)男性人群谷丙轉氨酶水平的流行病學因素及其相互作用分析 目的：在普通人群中，谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase,ALT)升高通常提示顯著的或者潛在的肝臟疾病，甚至會累計對全身健康造成威脅。因此，基于廣西防城港地區(qū)男性人群健康調(diào)查（The Fangchenggang AreaMale Healthy and Examination Survey, FAMHES）的結果，我們評估了影響該地區(qū)成年男性人群血清中ALT水平的流行病學因素以及他們之間的相互作用。 方法：在4304例受試者中，我們總共納入了2119例在2009年9月至2009年12月完成了完整的體格檢查，實驗室檢查，肝臟超聲檢查以及調(diào)查問卷的符合納入標準的受試者數(shù)據(jù)。 結果：在納入人群中，非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liverdisease, NAFLD）和代謝綜合征（metabolic syndrome, MetS）的患病率顯著相關于ALT水平的升高（P 0.05）。NAFLD和MetS的患病率密切相關（r=0.991，P=0.009）不正常的MetS各組分比例隨著ALT水平的升高成比例的明顯增加（P 0.01）。在隨后進行的多元線性回歸分析中，腹部肥胖指標體重指數(shù)（body mass index, BMI）和高脂血癥和ALT水平顯著相關（P 0.01）。在乙肝表面抗原（hepatitis B virus surface antigen, HBsAg）和MetS的交互作用研究中，我們并未發(fā)現(xiàn)其對于ALT水平有明顯交互作用。HBsAg和MetS之間對ALT影響的協(xié)同作用系數(shù)(synergy index,SI)為0.74，95%可信區(qū)間（confidence interval, CI）:0.71-0.80。 結論：在防城港地區(qū)男性人群中，NAFLD和MetS的患病率顯著相關于ALT水平。腹部肥胖和高脂血癥是導致ALT水平升高的獨立危險因素。這一發(fā)現(xiàn)提示在這一地區(qū)男性人群中，有必要在檢測ALT水平的過程中校正這些可能導致ALT水平升高的危險因素。 第一章 第二部分 針對前瞻性研究的循證醫(yī)學研究發(fā)現(xiàn)谷丙轉氨酶水平升高顯著相關于代謝綜合征的發(fā)生 目的：代謝綜合征（metabolic syndrome, MetS）的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)顯著升高且與谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase,ALT）活動水平緊密聯(lián)系。但是，ALT活動水平對MetS發(fā)生率的影響在已發(fā)表文獻中的報道并不一致。因此，我們針對前瞻性隊列研究通過薈萃分析的方法估算了ALT活動水平升高和MetS發(fā)生率之間的關系。 方法：收集所有已發(fā)表在Pubmed, Embase,和ISI數(shù)據(jù)庫中的研究ALT活動水平和MetS發(fā)生率之間關系的前瞻性隊列研究（文獻發(fā)表在2014年1月10日之前）。包括研究的國別，性別組成，納入人群的年齡，隨訪時間，MetS定義，校正因素，相對危險度（relative risk,RR）等具體指標直接或間接從最終納入文獻中提取或計算。我們將分別估計二分類變量的合并RR值及其95%可信區(qū)間（confidence interval, CI）（RR定義為高ALT水平組人群MetS發(fā)生率/低ALT水平組人群MetS發(fā)生率）和連續(xù)變量的合并RR值及95%CI(RR定義為ALT水平每升高5單位每升[unit perliter,U/l]人群中MetS發(fā)生率變化的比值)。如果組間異質(zhì)性不明顯（P值0.05以及I250%）,在計算合并RR值的過程中則采用固定效應模型；如果組間有顯著的差異性(P值≤0.05或I2≥50%)，則采用隨機效應模型。 結果：總共七篇前瞻性隊列研究，包含了31545例受試者和2873例在隨訪期間發(fā)生MetS的病例被納入本次研究。在比較高值ALT水平和低值ALT水平人群MetS發(fā)生率的差異中，合并估計的RR值為1.81(95%CI:1.49-2.14)。而在劑量-反應計算估計ALT水平每升高5U/l導致人群MetS發(fā)生率的變化中，合并估計的RR值為1.13（95%CI:1.11-1.16）。亞組分析發(fā)現(xiàn)性別差異可能是整個研究中異質(zhì)性的主要來源。在以性別為標準的亞組分析中，亞組之間劑量-反應(每5U/l)估算的合并RR值比較P=0.007。女性有比男性更高的劑量反應RR（1.38,95%CI:1.20-1.55）。進一步的，敏感度分析證實了結果的可靠性。本次薈萃分析并未發(fā)現(xiàn)顯著的發(fā)表偏倚。 結論：目前基于前瞻性研究的循證醫(yī)學證據(jù)支持ALT水平升高增加MetS發(fā)生風險的觀點。且這種關聯(lián)在女性人群中表現(xiàn)得更加緊密，一致性更好。這一關系有待更多的研究證實。同時ALT水平升高對MetS發(fā)生的潛在機制研究也有待進一步探索。 第二章 全基因組關聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)新的影響廣西防城港地區(qū)男性人群中血清谷丙轉氨酶水平的單核苷酸多態(tài)性位點及其生物信息學意義分析 目的：谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase, ALT）是評估肝臟疾病和全身健康的重要的生物標志物。ALT水平受到環(huán)境因素和遺傳因素的共同影響。因此我們實施了一項全基因組關聯(lián)研究（genome-wideassociation studies，GWAS），結合前期防城港地區(qū)男性健康調(diào)查（Fangchenggang Area Male Healthy and Examination Survey,FAMHES）結果，找出影響防城港地區(qū)男性健康人群的ALT水平的常見遺傳學變異及其與環(huán)境因素的交互作用。 方法：采集研究人群的外周靜脈血檢測血清提取脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid, DNA）樣本。在前期FAMHES納入的人群中，總共1999例健康男性的外周血樣進行全基因組單核苷酸多態(tài)性（SingleNucleotide Polymorphisms,SNPs）檢測，平臺為Illumina Omni One。在全基因組SNPs分型的基礎之上，采用校正了年齡，體重指數(shù)（body massindex, BMI）,甘油三酯（triglycerides,TG）變量的多元線性回歸模型，尋找可能影響該地區(qū)男性人群ALT水平的常見遺傳變異標志。進一步地，全基因組關聯(lián)分析在以乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）為分類標準的亞組中進行比較。全基因組關聯(lián)分析統(tǒng)計學檢驗顯著性水平的檢驗標準為P1*10 5,在乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）陽性人群中的統(tǒng)計學檢驗顯著性水平的檢驗標準為P0.05�；蚍中偷馁|(zhì)量控制標準：滿足哈 溫平衡（Hardy Weinberg Equilibrium，HWE檢驗P＞0.001）;最小等位基因頻率0.01；基因分型成功率(call rate)＞0.95。采用非參數(shù)檢驗（Mann Whitney Test）的方法比較以HBsAg和MetS分類的亞組中不同SNP基因型之間的ALT值。最后，采用交互作用的流行病學模型，結合潛在遺傳變異和常見的影響ALT水平的表型因素（包括代謝綜合征[metabolic syndrome, MetS]和乙肝病毒[hepatitis B virus, HBV]感染）,評估遺傳變異和表型因素之間的交互作用。 結果：本次GWAS總共發(fā)現(xiàn)位于5個基因區(qū)域的7個SNPs經(jīng)全基因組關聯(lián)分析統(tǒng)計學檢驗后，顯著性水平P1*10-5,包括：位于SLC35F3基因1q42.2上的rs10157061(P=7.46*10-7),rs10752781(P=1.29*10-6),rs1878544(P=2.16*10-6)；位于CUX2基因12q24.12上的rs4766453(P=1.11*10-6)；位于SHANK1基因19q13.3上的rs4801847(P=3.26*10-6)；位于WWOX基因上16q23.3上的rs2010020(P=7.73*10-6)；位于CYP1A2基因15q24.1的rs3743484(P=8.20*10-6)。其中位于2個基因區(qū)域的4個SNPs(位于SLC35F3基因1q42.2上的rs10157061,rs10752781,rs1878544；位于CUX2基因12q24.12上的rs4766453)經(jīng)全基因組關聯(lián)分析統(tǒng)計學檢驗后顯著性水平P3*10-6。在HBsAg陽性人群中，位于SLC35F3基因1q42.2上的rs10157061,rs10752781,rs1878544；位于WWOX基因上16q23.3上的rs2010020；位于CYP1A2基因15q24.1的rs3743484同時達到在HBsAg陽性人群中的統(tǒng)計學效力（P0.05）。在結合SNP基因型和MetS，HBsAg表型分組的的亞組分析中，各亞組間人群ALT值仍然SNP基因型的變化而有所差異(P0.05)。我們發(fā)現(xiàn)潛在意義較大(P3*10-6)的候選SNPs（包括位于SLC35F3基因1q42.2上的rs10157061, rs10752781, rs1878544；位于CUX2基因12q24.12上的rs4766453）和陽性HBsAg之間對ALT水平的影響的協(xié)同效應系數(shù)[synergy index, SI]及其95%可行區(qū)間（confidenceinterval，CI）均大于1。 結論：因此，一項針對防城港地區(qū)成年男性人群的GWAS發(fā)現(xiàn)了新的影響人群血清中ALT水平的常見遺傳變異標記。其中SLC35F3和CUX2可能是影響該地區(qū)成年男性血清ALT水平的易感基因。但是這種效應可能因為人群的肝炎病毒感染背景不同而有所不同。SNPs對人群ALT水平的影響可能會在HBV感染的背景下擴大。候選SNPs及其所在基因區(qū)域為個體化醫(yī)學診斷和治療提供了潛在的遺傳學標記。同時為下一步的驗證ALT水平的遺傳學機制提供了有意義的靶點。潛在SNPs及其所在基因區(qū)域對ALT水平的影響機制有待進一步研究證實。 第三章 第一部分 全基因組關聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)的新的影響防城港地區(qū)男性人群血清谷丙轉氨酶水平的單核苷酸多態(tài)性位點在永生化肝細胞株中的驗證 目的：基于前期針對防城港地區(qū)男性健康調(diào)查（Fangchenggang AreaMale Healthy and Examination Survey,FAMHES）人群全基因組關聯(lián)研究（genome-wide association study,GWAS）的結果，我們發(fā)現(xiàn)了新的影響防城港地區(qū)健康男性血清谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase, ALT）水平的單核苷酸多態(tài)性位點（single nucleotide polymorphisms,SNPs）。但是GWAS發(fā)現(xiàn)的SNPs與表型特征之間可能存在假關聯(lián)。因此，我們選取永生化肝細胞株為研究對象其中候選SNPs與其上清液ALT水平之間的關聯(lián)關系。同時對SNPs坐落的基因，GPT基因（肝臟ALT編碼基因）及其編碼蛋白表達水平進行檢測，在細胞株層面探討候選SNPs坐落基因及其編碼蛋白的表達水平與GPT基因及編碼蛋白表達水平及各細胞株表型（即各細胞株上清液ALT水平）之間存在的關系。 方法：選取BEL-7402，BEL-7404，HL-7702，SMMC-7721，Hep-G2，MHCC-97H,MHCC-97L共7株永生化肝細胞株作為研究對象，通過細胞培養(yǎng)繁殖，消化貼壁細胞后提取細胞用做以下實驗：1.提取細胞脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA），，針對目的SNPs設計普通聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction,PCR）引物,通過PCR反應獲得擴增產(chǎn)物。產(chǎn)物以sanger雙向測序法獲得目的SNPs（左右約50個堿基對[base-pairs,BP]）片段序列,從而獲得目的SNPs的基因型結果；2.提取細胞株上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immuno sorbentassay，elisa）的方法獲取各細胞株上清液ALT值；3.針對候選SNPs坐落基因，設計特異性實時熒光定量PCR（real-time PCR）引物,檢測不同基因型的肝細胞株間目的基因和ALT基因的表達情況；4.提取細胞的總蛋白，設計針對目的基因編碼蛋白的特異性抗體，采用蛋白印跡（western-blot）的方法觀察特異蛋白的表達情況；4.將消化細胞接種到無菌玻璃片上，采用特異性抗體免疫組化（Immunohistochemistry，IHC）的方法觀察各特異蛋白在不同細胞株中的表達部位以及表達量變化。 細胞實驗均采取三次重復，計量指標采用平均值±標準差（mean±standard deviation [SD]）表示。各細胞株間上清液ALT值，目的基因表達量及目的蛋白表達量之間比較采用非參數(shù)檢驗Mann-Whitney U檢驗的方法進行。表達量相關性比較采用pearson相關系數(shù)計算。P0.05被認為有顯著統(tǒng)計學差異。 結果：總共7個永生化肝細胞株中，在其中3個基因區(qū)域的5個SNPs上表現(xiàn)出多態(tài)性，所有候選SNPs在細胞株中均表現(xiàn)為純合子。7個細胞株按照其攜帶的不同SNPs的高值等位基因數(shù)目分布的不同分為3組：其中A組細胞株MHCC-97H和MHCC-97L在位于SLC35F3基因1q42.2區(qū)域上的rs10157061,rs10752781, rs1878544；位于CUX2基因12q24.12區(qū)域上的rs4766453；位于SHANK1基因19q13.3上的rs4801847共5個SNPs上均攜帶高值等位基因，B組細胞株SMMC-7721在位于SHANK1基因上的rs4801847SNP上攜帶高值等位基因，C組細胞株（包括BEL-7402，BEL-7404，HepG2，HL-7702）在總共位于5個基因區(qū)域的7個SNPs上均攜帶低值等位基因。經(jīng)比較，A組MHCC-97H和MHCC-97L細胞株在上清液ALT值顯著高于其他各組細胞株ALT值，B組SMMC-7721細胞株與C組細胞株間上清液ALT值差異無統(tǒng)計學顯著性。實時熒光定量PCR的結果提示A組GPT基因表達水平高于B組，C組，但SLC35F3的表達水平和GPT基因表達水平呈現(xiàn)顯著負相關（r2=-0.672，P=0.001），CUX2的表達水平在不同基因型分組中，組間表達差異無統(tǒng)計學顯著性（P0.05）。實時熒光定量PCR結果得到了蛋白印跡和免疫組化結果的印證。在蛋白印跡實驗中，A組SLC35F3編碼蛋白表達水平顯著低于B組，C組，差異有統(tǒng)計學顯著性（P0.05）。A組GPT編碼蛋白表達水平顯著高于B組，C組，差異有統(tǒng)計學顯著性（P0.05）。CUX2編碼蛋白組間表達無統(tǒng)計學差異（P0.05）。各組間SLC35F3和GPT蛋白表達水平存在明顯負相關（r=-0.527， P=0.002）。免疫組化實驗印證了蛋白印跡結果。 結論：基于FAMHES的GWAS研究中發(fā)現(xiàn)的影響男性人群血清ALT水平的SNPs，我們結合體外細胞學驗證得出：1.位于SLC35F3基因1q42.2上的顯著影響人群血清ALT水平的候選SNPs（包括rs10157061，rs10152781,rs1878544）同時顯著影響SLC35F3基因和蛋白表達水平。高值等位基因對應SLC35F3基因和編碼蛋白的低表達。2. SLC35F3基因可能是影響肝細胞ALT分泌水平的易感基因。SLC35F3的基因和編碼蛋白的表達水平的上調(diào)與GPT基因的低表達及細胞ALT的低水平相關。位于1q42.2上的強連鎖不平衡區(qū)域的rs10157061，rs10152781,rs1878544可能通過影響SLC35F3的基因和蛋白表達水平間接地影響和調(diào)控了肝細胞ALT水平。相關機制有待進一步研究證實。 第三章 第二部分 低濃度乙醇暴露下永生化肝細胞株MHCC-97H和BEL7402中SLC35F3基因表達研究 背景和目的：基于前期細胞株驗證的初步結果，我們發(fā)現(xiàn)SLC35F3基因可能對體外永生化肝細胞株中谷丙轉氨酶（glutamic-pyruvictransamine GPT）基因表達水平，上清液谷丙轉氨酶（alanineaminotransferase,ALT）水平存在影響。SLC35F3基因及其編碼蛋白的低表達關聯(lián)于GPT基因的高表達和ALT值的升高。但永生化肝細胞株在外界環(huán)境壓力下，SLC35F3和GPT的表達情況仍不得而知。因此，我們設計了低濃度乙醇干預實驗，觀察體外永生化肝細胞株SLC35F3，GPT基因及其編碼蛋白表達情況，及其相互關系。 方法：選取永生化肝細胞株BEL-7402和MHCC-97H作為研究對象。分別以50mmol/l,100mmol/l,和200mmol/l的乙醇濃度干預永生化肝細胞株，并觀察永生化肝細胞株在3小時，6小時，12小時，24小時不同時間節(jié)點的ALT分泌值，SLC35F3，GPT基因及其編碼蛋白表達值 選取BEL-7402，MHCC-97H兩株永生化肝細胞株作為研究對象，通過細胞培養(yǎng)繁殖，消化吹散后均勻接種于24孔板中，貼壁后觀察細胞，分別以50mmol/l,100mmol/l,和200mmol/l的乙醇濃度干預永生化肝細胞株，并觀察永生化肝細胞株在3小時，6小時，12小時，24小時不同時間節(jié)點對永生化肝細胞株進行以下處理：1.提取細胞株上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immuno sorbent assay，elisa）的方法獲取各細胞株上清液ALT值；2.針對SLC35F3和GPT基因，設計特異性實時熒光定量PCR（real-time PCR）引物,檢測不同細胞株不同時間-濃度乙醇干預水平下SLC35F3和GPT基因表達水平；3.提取細胞株在不同時間-濃度乙醇干預水平下細胞的總蛋白，設計針對SLC35F3和GPT基因編碼蛋白的特異性抗體，采用蛋白印跡（western-blot，WB）的方法觀察特異蛋白的表達情況；4.將不同時間-濃度乙醇干預水平下的細胞消化后，接種到無菌玻璃片上，采用特異性抗體免疫組化（Immunohistochemistry，IHC）的方法觀察各SLC35F3和GPT特異蛋白在不同細胞株中的表達部位以及表達量變化。 細胞實驗均采取三次重復，計量指標采用平均值±標準差（mean±standard deviation [SD]）表示。組間比較統(tǒng)計學方法使用遵循以下原則：如數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，則比較選用方差分析（one-way ANOVA）;如數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，則比較選用非參數(shù)檢驗（Mann-Whitney U test）。除非特殊說明，P0.05被認為是有顯著統(tǒng)計學差異。 結果：我們檢測了不同時間-濃度乙醇干預濃度下BEL-7402和MHCC-97H兩株細胞的上清液分泌值，SLC35F3，GPT兩基因表達，編碼蛋白表達情況。具體結果如下：1. BEL-7402ALT達峰時間穩(wěn)定在6小時，而MHCC-97H ALT達峰時間由100mmol/l乙醇干預下的12小時，縮短至200mmol/l乙醇干預下的3小時。不同濃度酒精干預下，BEL-7402的ALT峰值水平差別無統(tǒng)計學顯著性（P0.05），MHCC-97H的ALT峰值水平隨著乙醇干預濃度的加大而升高，差別有統(tǒng)計學顯著性（P0.05）；2.不同時間-濃度乙醇干預下BEL-7402和MHCC-97H的SLC35F3及GPT基因表達水平存在差異。BEL-7402的SLC35F3基因和GPT基因分別在12小時和6小時達到峰值，相對穩(wěn)定，且隨乙醇暴露濃度的增加峰值水平變化不大,差別無統(tǒng)計學顯著性（P0.05）。而MHCC-97H的SLC35F3基因和GPT基因表達水平的達峰時間和峰值表達水平隨著不同干預濃度的變化較大，其達峰時間從50mmol/l乙醇暴露下的24小時，提前到200mmol/l乙醇暴露下的3小時。峰值水平隨著乙醇暴露濃度的升高而升高，差異有統(tǒng)計學顯著性（P0.05）。3.蛋白印跡半定量結果顯示：BEL-7402SLC35F3和GPT基因編碼蛋白表達達峰時間穩(wěn)定在12小時和6小時，而MHCC-97H SLC35F3和GPT基因編碼蛋白表達達峰時間隨著乙醇暴露濃度的增加而提前，由200mmol/l乙醇暴露下SLC35F3和GPT編碼蛋白表達水平高于相應的50mmol/l和100mmol/l乙醇干預濃度下的表達水平（P0.05）。免疫組化結果與蛋白印跡觀察結果一致。 結論：在應激環(huán)境下，基礎高表達SLC35F3基因的BEL-7402表現(xiàn)出在體外環(huán)境下表現(xiàn)出比低表達SLC35F3基因的MHCC-97H細胞株更強的自身穩(wěn)定性和對乙醇的低度易感性，及其更小的損傷。SLC35F3基因的基礎表達水平可能與乙醇干預下肝細胞自身調(diào)節(jié)及ALT代謝機制有關。在基礎狀態(tài)下SLC35F3基因的高表達有利于在應對乙醇刺激時，降低乙醇損傷的易感性，減輕乙醇所致的肝臟損傷。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R575.5;R589

【參考文獻】

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1 董榮春,周榮華,呂發(fā)度,陶文照;SMMC-7721人體肝癌細胞株的建立及其生物學特性的初步觀察[J];第二軍醫(yī)大學學報;1980年01期

2 陳瑞銘,朱德厚,葉秀珍,沈鼎武,陸榮華;體外培養(yǎng)三個人體肝癌細胞系的建立及其特征[J];中國科學;1979年12期

本文編號：1955200