發(fā)布時(shí)間：2018-03-02 10:33

  本文關(guān)鍵詞： 人工鋅指蛋白 真核表達(dá) 乙型肝炎病毒 X蛋白 拉米夫定　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:構(gòu)建特異性結(jié)合乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus, HBV）X基因啟動(dòng)子（X gene promoter，Xp）的鋅指蛋白（zinc finger protein，ZFP），并與拉米夫定體外抗乙肝病毒效果進(jìn)行比較。 方法:1.設(shè)計(jì)特異性結(jié)合HBV Xp的ZFP并載入真核表達(dá)載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒nls-ZFP-kRAB-Flag （pcDNA3.1+，ATF）、nls-ZFP-Flag（pcDNA3.1+，ZFP1）、nls-kRAB-Flag（pcDNA3.1+，，ZFP2）。2.通過(guò)酶切、測(cè)序鑒定重組質(zhì)粒的正確性。3.Western blot和細(xì)胞免疫熒光技術(shù)鑒定重組質(zhì)粒在HepG2.2.15細(xì)胞中的表達(dá)情況。4.將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞，設(shè)空白組（Blank組）、ATF組、ZFP1組、ZFP2組、空質(zhì)粒組（Empty vctor組）和拉米夫定組（3TC組），分別培養(yǎng)2d、6d、10d。用Western blot檢測(cè)各組HBx蛋白的表達(dá)情況；FQ-PCR檢測(cè)各組HBV DNA復(fù)制的拷貝數(shù)；ELASA技術(shù)檢測(cè)各組HepG2.2.15細(xì)胞上清中HBsAg和HBeAg的濃度。 結(jié)果:1:特異性的ATF能在HepG2.2.15細(xì)胞中表達(dá)。2: ATF和3TC對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞中X蛋白和HBV DNA的表達(dá)在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)具有明顯抑制作用（P0.05)，且ATF的抑制作用強(qiáng)于3TC（P0.05），6d和10d作用強(qiáng)于2d（P0.05）。3: ATF組和3TC組上清中HBsAg、HBeAg的濃度顯著降低，即ATF組和3TC組對(duì)HBsAg、HBeAg的抑制率高與其余三組（P0.01），且ATF的抑制率高于3TC（P0.01）。4: ZFP1和ZFP2對(duì)X蛋白和HBV DNA無(wú)抑制作用。 結(jié)論:人工設(shè)計(jì)的特異性ATF在真核細(xì)胞中能正常表達(dá)，并和拉米夫定一樣都有明顯抗HBV作用，他們的作用機(jī)制不同，且作用強(qiáng)于拉米夫定。
[Abstract]:Aim: to construct a zinc finger protein (ZINC finger protein HBV)X) specifically bound to hepatitis B virus (HBV)X) promoter X gene promoter, and to compare the antiviral effect of lamivudine with lamivudine in vitro. Methods 1. To design a ZFP specifically bound to HBV XP and load it into eukaryotic expression vector, construct the recombinant plasmid nls-ZFP-kRAB-Flag pcDNA3.1 + ATFP-Flagagnls-ZFP-Flagus pcDNA3.1 nls-kRAB-FlagDNA pc3.1nls-kRAB-FlagDNA pc3.1 + ZFP2N2.The recombinant plasmid pcDNA3.1 was digested by enzyme digestion, and the recombinant plasmid pcDNA3.1 was inserted into the eukaryotic expression vector. The correctness of the recombinant plasmid was confirmed by sequencing. 3. Western blot and immunofluorescence technique were used to identify the expression of the recombinant plasmid in HepG2.2.15 cells. The recombinant plasmid was transfected into HepG2.2.15 cells. Empty plasmid group (empty vctor group) and lamivudine group (3TC group) were cultured for 2 days, 6 days and 10 days, respectively. The expression of HBx protein in each group was detected by Western blot. The copy number of HBV DNA replication was detected by FQ-PCR and the concentration of HBsAg and HBeAg in the supernatant of HepG2.2.15 cells in each group was detected by ELASA technique. Results the specific ATF in HepG2.2.15 cells showed significant inhibitory effects on the expression of X protein and HBV DNA in HepG2.2.15 cells at three time points, and the inhibitory effect of ATF on the expression of X protein and HBV DNA in HepG2.2.15 cells was stronger than that in 3TCU P0.05D and 10d groups. 3The concentration of HBsAg HBeAg in the supernatant of TC group was significantly lower than that in the control group. In other words, the inhibition rate of ATF and 3TC on HBsAg HBeAg was higher than that of the other three groups, and the inhibitory rate of ATF was higher than that of 3TCX P0.01HBeAg. 4: ZFP1 and ZFP2 had no inhibitory effect on X protein and HBV DNA. Conclusion: the artificially designed specific ATF can express normally in eukaryotic cells and has the same anti-#en1# effect as lamivudine. The mechanism of their action is different and stronger than that of lamivudine.
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R512.62;Q78

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本文編號(hào)：1556158