發(fā)布時間：2018-02-28 01:51

  本文關(guān)鍵詞： SREBP-1c ChREBP FASN 組蛋白修飾 NAFLD　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景和目的:非酒精性脂肪肝病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指除外酒精以及其他明確病理損傷因素所致的肝細胞內(nèi)脂質(zhì)過度沉積的病理綜合征。研究表明胰島素抵抗在NAFLD眾多致病因素中具有重要作用,并貫穿(或參與)NAFLD發(fā)生發(fā)展的始終。因此探索胰島素對脂質(zhì)從頭合成的調(diào)節(jié)機制,對深入了解NAFLD的發(fā)病機理有重要的意義。固醇調(diào)控原件結(jié)合蛋白(Stero responsive element binding protein,SREBP-1c)是胰島素依賴調(diào)控脂質(zhì)合成的重要轉(zhuǎn)錄因子。碳水化合物反應(yīng)原件結(jié)合蛋白)(Carbohydrate responsive element binding protein,Ch REBP)不僅是葡萄糖依賴也是胰島素依賴的調(diào)控脂質(zhì)合成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。在胰島素刺激下SREBP-1c和Ch REBP均能誘導(dǎo)脂質(zhì)從頭合成關(guān)鍵酶-脂肪酸合成酶(Fatty acids synthase,FASN)轉(zhuǎn)錄激活。FASN基因被過度轉(zhuǎn)錄激活是導(dǎo)致肝細胞脂肪變的重要基礎(chǔ)。正常狀態(tài)下染色質(zhì)處于致密狀態(tài)會阻止基因轉(zhuǎn)錄激活,組蛋白修飾能在不改變DNA序列的情況下,通過影響組蛋白與DNA之間的相互作用,即改變?nèi)旧�質(zhì)的疏松或凝集轉(zhuǎn)態(tài),為信號分子與靶基因結(jié)合提供空間,最終起到調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的作用。在胰島素刺激下SREBP-1c及Ch REBP介導(dǎo)的FASN轉(zhuǎn)錄激活的過程中也必然存在組蛋白修飾,但是其具體種類及機制仍不清楚。本研究對由FASN基因過度轉(zhuǎn)錄激活而導(dǎo)致的肝細胞脂肪變具有重要意義,亦為NAFLD潛在的治療靶點提供新的證據(jù)。鑒于此,本課題首先建立高濃度胰島素誘導(dǎo)的肝細胞脂肪變模型,并在此基礎(chǔ)上探討高濃度胰島素對肝細胞FASN基因啟動子區(qū)域組蛋白修飾的影響,以及FASN基因轉(zhuǎn)錄激活與這些組蛋白修飾的關(guān)系,SREBP-1c和Ch REBP對胰島素刺激下FASN基因啟動子區(qū)組蛋白修飾的作用。最后我們深入研究了組蛋白乙�；�修飾如何影響肝細胞FASN基因的轉(zhuǎn)錄表達,從而導(dǎo)致肝細胞脂變的可能機制。方法:一、胰島素介導(dǎo)的FASN基因啟動子肝細胞區(qū)組蛋白修飾、基因轉(zhuǎn)錄與肝細胞脂質(zhì)沉積的關(guān)系1、胰島素刺激Hep G2和原代肝細胞的最佳濃度。按照文獻報道設(shè)置胰島素濃度:0.5、0.75、1.0、1.25u M分別刺激Hep G2和原代肝細胞24h,MTT檢測細胞活性。2、胰島素對肝細胞脂質(zhì)沉積的影響。最佳濃度胰島素干預(yù)Hep G2細胞和原代肝細胞24和48h后用TG酶法檢測TG含量,油紅O染色檢測脂滴沉積。3、胰島素對肝細胞FASN基因轉(zhuǎn)錄及表達的影響。最佳濃度胰島素分別刺激Hep G2、原代肝細胞0、1、2、4、8、12、16、24h,或胰島素刺激Hep G2、原代肝細胞12h或4h后撤除胰島素刺激,在胰島素刺激或撤除刺激的0、1、2、4、8、12、16、24h,分別用q RT-PCR檢測FASN m RNA表達,用Western-blot檢測各時間點FASN蛋白表達。4、胰島素刺激Hep G2細胞和原代肝細胞后FASN基因啟動子區(qū)域的染色質(zhì)重塑事件。根據(jù)胰島素刺激或撤除胰島素刺激后FASN轉(zhuǎn)錄時間譜,選取FASN m RNA開始增加或者降低的時間點作為研究染色質(zhì)重塑的時間點。通過染色質(zhì)免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation,Ch IP)技術(shù),利用抗組蛋白H3K4甲基化、H3K9甲基化、H4K20甲基化、H3S10磷酸化、H3乙�；�、H4乙�；�抗體、比較胰島素作用對FASN基因轉(zhuǎn)錄起始點5’上游-2000bp、tss、第二外顯子(exon2)組蛋白甲基化、磷酸化、乙�；�修飾的影響。二、SREBP-1c或Ch REBP對胰島素刺激下FASN基因啟動子區(qū)域組蛋白修飾的影響1、胰島素刺激對肝細胞SREBP-1c、Ch REBP蛋白表達的影響最佳濃度胰島素刺激Hep G2和原代肝細胞0、1、2、4、8、12、16、24h,用Western-blot檢測各組細胞SREBP-1c及Ch REBP表達水平。2、胰島素刺激肝細胞后SRBEP-1c、Ch REBP核轉(zhuǎn)位最佳濃度胰島素刺激肝細胞0h、24h,免疫熒光檢測SREBP-1c、Ch REBP細胞內(nèi)定位。3、抑制肝細胞SREBP-1c或Ch REBP表達對FASN表達的影響si RNA-SREBP-1c、si RNA-Ch REBP質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染Hep G2細胞,sh RNA-SREBP-1c、sh RNA-Ch REBP慢病毒轉(zhuǎn)染原代肝細胞。Western blot檢測Ch REBP、SREBP-1c以及FASN蛋白表達。4、抑制肝細胞SREBP-1c或Ch REBP表達對胰島素刺激下肝細胞SREBP-1c-SRE、Ch REBP-Ch ORE結(jié)合水平的影響si RNA-SREBP-1c、si RNA-Ch REBP質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染Hep G2細胞,sh RNA-SREBP-1c、sh RNA-Ch REBP慢病毒轉(zhuǎn)染原代肝細胞。Ch IP比較空白組、陽性對照組(最佳濃度胰島素刺激)、轉(zhuǎn)染組、陰性對照組(轉(zhuǎn)染p EX3-scramble質(zhì)�；蜿幮詫φ章�病毒后用胰島素刺激)FASN基因啟動子區(qū)域SREBP-1c-SRE、Ch REBP-Ch ORE結(jié)合水平。5、SREBP-1c和Ch REBP對胰島素刺激下肝細胞FASN基因啟動子區(qū)組蛋白修飾的影響si RNA-SREBP-1c、si RNA-Ch REBP質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染Hep G2細胞,sh RNA-SREBP-1c、sh RNA-Ch REBP慢病毒轉(zhuǎn)染原代肝細胞。Ch IP比較空白組、陽性對照組(最佳濃度胰島素刺激)、轉(zhuǎn)染組、陰性對照組(轉(zhuǎn)染p EX3-scramble質(zhì)粒或陰性對照慢病毒后用胰島素刺激)FASN基因啟動子區(qū)域組蛋白修飾事件。三、組蛋白乙�；�修飾對胰島素刺激下肝細胞脂肪變性的影響Hep G2、原代肝細胞分為空白組、胰島素組(胰島素刺激Hep G2細胞12h,刺激原代肝細胞8h)、胰島素+組蛋白乙酰化酶抑制劑(Histong acetyltransrease,HAT)組。根據(jù)文獻報道以及前期實驗結(jié)果,選取5u M作為Garcionl處理肝細胞最適濃度。Ch IP檢測FASN基因啟動子區(qū)域H3、H4乙酰化修飾以及SREBP-1c-SRE、Ch REBP-Cho RE結(jié)合水平。Western-blot檢測FASN、SREBP-1c、Ch REBP表達水平。Hep G2和原代肝細胞用胰島素刺激48h以及Garcionl與胰島素共刺激48h后油紅O檢測細胞內(nèi)脂滴。結(jié)果:一、胰島素介導(dǎo)的FASN基因啟動子肝細胞區(qū)組蛋白修飾、基因轉(zhuǎn)錄與肝細胞脂質(zhì)沉積的關(guān)系1、MTT結(jié)果顯示:1.25u M為胰島素刺激Hep G2細胞和原代肝細胞最適濃度。2、Western blot結(jié)果顯示:胰島素刺激下,Hep G2細胞和原代肝細胞內(nèi)FASN蛋白水平隨著刺激時間延長而表達增加(p0.05)。3、TG及油紅O測定顯示:1.25u M胰島素刺激Hep G2細胞和原代肝細胞24及48h后,肝細胞內(nèi)TG及脂滴含量均較0h明顯增加(p0.05)。證明胰島素誘導(dǎo)肝細胞脂肪變模型構(gòu)建成功。4、q RT-PCR結(jié)果顯示:當1.25u M胰島素刺激Hep G2細胞4h時,細胞內(nèi)FASN m RNA轉(zhuǎn)錄水平較0h明顯增高,至12h時,FASN m RNA轉(zhuǎn)錄水平到達峰值(P0.05)。1.25u M胰島素刺激Hep G2細胞12h時撤除胰島素刺激,在撤除胰島素刺激1h時,FASN m RNA轉(zhuǎn)錄水平較0h明顯下降(P0.05)。當1.25u M胰島素刺激原代肝細胞1h時,細胞內(nèi)FASN m RNA轉(zhuǎn)錄水平較0h明顯增高,至4h時,FASN m RNA轉(zhuǎn)錄水平到達峰值(P0.05)。1.25u M胰島素刺激原代肝細胞4h時,撤除胰島素刺激,在撤除胰島素刺激1h時,FASN m RNA轉(zhuǎn)錄水平較0h明顯下降(P0.05)。由于染色質(zhì)重塑事件一般發(fā)生在基因轉(zhuǎn)錄早期,因此我們選擇胰島素刺激Hep G2細胞4h、撤除胰島素刺激1h;胰島素刺激原代肝細胞1h、撤除胰島素刺激1h,作為研究胰島素介導(dǎo)的FASN基因啟動子區(qū)域組蛋白修飾時間的時間點。5、Ch IP結(jié)果顯示:胰島素分別刺激Hep G2或原代肝細胞4h或1h后,與0h相比,此時FASN m RNA轉(zhuǎn)錄出現(xiàn)明顯上調(diào),FASN基因啟動子區(qū)域tss位點H3K4三甲基化、H3S10磷酸化、H3乙�；�、H4乙�；�水平顯著升高(P0.05),而H3K9三甲基化、H4K9三甲基化水平下降(P0.05)。-2kb以及exon2位點無明顯改變(P0.05)。胰島素分別刺激Hep G2和原代肝細胞12h和4h后撤除刺激,相比0h,在撤除刺激1h后FASN m RNA轉(zhuǎn)錄水平明顯下調(diào),FASN基因啟動子區(qū)域tss位點H3K4三甲基化、H3S10磷酸化、H3乙�；�、H4乙�；�水平降低,H3K9三甲基化、H4k20三甲基化水平明顯升高(P0.05)。-2kb和exon2位點無明顯改變(P0.05)。二、SREBP-1c或Ch REBP對胰島素刺激下FASN基因啟動子區(qū)域組蛋白修飾的影響1、Western-blot結(jié)果顯示:胰島素刺激Hep G2或原代肝細胞后,SREBP-1c及Ch REBP蛋白水平明顯升高,且隨著時間的延長而表達增加。在Hep G2細胞中SREBP-1c表達在8h開始升高,Ch REBP表達在4h開始升高。在原代肝細胞中SREBP-1c表達在1h開始升高,Ch REBP表達在2h開始升高。2、Western-blot結(jié)果顯示:抑制Hep G2細胞及原代肝細胞中SREBP-1c或Ch REBP表達后,即使分別再予12h及4h的胰島素刺激,SREBP-1c或Ch REBP抑制組FASN蛋白表達水平仍較胰島素刺激組明顯受抑制。說明胰島素需通過SREBP-1c或Ch REBP調(diào)控FASN的表達。3、免疫熒光結(jié)果顯示:1.25u M胰島素刺激Hep G2細胞及原代肝細胞各24h后,細胞核中的綠色熒光較正常組明顯增多,即胰島素刺激促進SREBP-1c、Ch REBP由胞漿轉(zhuǎn)位至胞核中。4、Ch IP結(jié)果顯示:在1.25u M胰島素刺激下,抑制Hep G2和原代肝細胞SREBP-1c或Ch REBP蛋白表達,與胰島素刺激組相比,FASN基因SREBP-1c-SRE、Ch REBP-Cho RE結(jié)合水平均明顯降低(p0.05)。5、Ch IP結(jié)果顯示:抑制Hep G2和原代肝細胞中SREBP-1c表達,FASN基因tss、SRE位點H3乙酰化及H4乙�；�水平較陽性對照組明顯下降(P0.05)。而H3K4三甲基化修飾則無明顯下降。而抑制Hep G2和原代肝細胞中Ch REBP表達FASN基因tss、Ch ORE位點H3乙�；�及H4乙�；�水平較陽性組明顯下降(p0.05)。H3K4三甲基化同樣無明顯下降。同時抑制SREBP-1c和Ch REBP,FASN基因tss位點H3及H4乙�；�水平下降較單獨抑制SREBP-1c或Ch REBP下調(diào)更加明顯。結(jié)果提示FASN基因啟動子區(qū)H3K4修飾水平并非僅受SREBP-1c和Ch REBP影響,而H3和H4乙酰化修飾水平則主要受SREBP-1c和Ch REBP影響。且SREBP-1c及Ch REBP協(xié)同參與了胰島素刺激下肝細胞FASN基因啟動子區(qū)組蛋白修飾。三、組蛋白乙�；瘜σ葝u素刺激下肝細胞脂肪變的影響1、Ch IP結(jié)果顯示:在胰島素刺激下同時抑制HAT活性,能顯著下調(diào)胰島素誘導(dǎo)的Hep G2及原代肝細胞FAS基因啟動子區(qū)域H3、H4乙�；�水平(P0.05)。2、Ch IP結(jié)果顯示:在胰島素刺激下同時抑制HAT活性,能降低Hep G2細胞及原代肝細胞Ch REBP-Ch ORE結(jié)合水平(P0.05)。3、Western-blot結(jié)果顯示:在胰島素刺激下同時抑制HAT活性,與胰島素刺激組相比較,抑制組肝細胞FASN蛋白上調(diào)幅度明顯降低,而SREBP-1C和Ch REBP表達水平則無明顯改變。4、油紅染色顯示:在胰島素刺激下同時抑制HAT活性,細胞內(nèi)脂滴較單純胰島素刺激組減少。結(jié)論:1.25u M胰島素可誘導(dǎo)Hep G2細胞和原代肝細胞脂肪沉積。胰島素刺激能促進FASN基因轉(zhuǎn)錄,同時伴隨FASN基因啟動子區(qū)域組蛋白H3K4三甲基化、H3S10磷酸化、H3乙�；�、H4乙酰化升高,H3K9及H4K20三甲基化水平降低,胰島素撤除后FASN基因轉(zhuǎn)錄降低,FASN基因啟動子區(qū)域組蛋白H3K4三甲基化、H3乙�；�、H4乙�；�降低,H3K9及H4K20三甲基化水平升高。胰島素通過調(diào)控SREBP-1c以及Ch REBP表達來影響FASN基因轉(zhuǎn)錄表達,而SREBP-1c或Ch REBP則通過增強與FASN基因啟動子調(diào)控區(qū)域SRE或Ch ORE結(jié)合并誘導(dǎo)FASN基因H3、H4乙酰化,發(fā)揮對FASN基因的調(diào)控作用。在胰島素作用下,Garcinol抑制HAT活性并不能抑制SREBP-1c或Ch REBP的表達,而是通過干擾SREBP-1c和Ch REBP與FASN基因啟動子區(qū)域SRE、Ch ORE結(jié)合,降低其轉(zhuǎn)錄活性進而干擾FASN蛋白的表達。說明組蛋白乙�；�修飾是胰島素刺激下SREBP-1c及Ch REBP介導(dǎo)的FASN轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要機制之一。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R575

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