發(fā)布時(shí)間：2018-02-28 01:51

  本文關(guān)鍵詞： SREBP-1c ChREBP FASN 組蛋白修飾 NAFLD　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景和目的:非酒精性脂肪肝病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指除外酒精以及其他明確病理損傷因素所致的肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過度沉積的病理綜合征。研究表明胰島素抵抗在NAFLD眾多致病因素中具有重要作用,并貫穿(或參與)NAFLD發(fā)生發(fā)展的始終。因此探索胰島素對(duì)脂質(zhì)從頭合成的調(diào)節(jié)機(jī)制,對(duì)深入了解NAFLD的發(fā)病機(jī)理有重要的意義。固醇調(diào)控原件結(jié)合蛋白(Stero responsive element binding protein,SREBP-1c)是胰島素依賴調(diào)控脂質(zhì)合成的重要轉(zhuǎn)錄因子。碳水化合物反應(yīng)原件結(jié)合蛋白)(Carbohydrate responsive element binding protein,Ch REBP)不僅是葡萄糖依賴也是胰島素依賴的調(diào)控脂質(zhì)合成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。在胰島素刺激下SREBP-1c和Ch REBP均能誘導(dǎo)脂質(zhì)從頭合成關(guān)鍵酶-脂肪酸合成酶(Fatty acids synthase,FASN)轉(zhuǎn)錄激活。FASN基因被過度轉(zhuǎn)錄激活是導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪變的重要基礎(chǔ)。正常狀態(tài)下染色質(zhì)處于致密狀態(tài)會(huì)阻止基因轉(zhuǎn)錄激活,組蛋白修飾能在不改變DNA序列的情況下,通過影響組蛋白與DNA之間的相互作用,即改變?nèi)旧�質(zhì)的疏松或凝集轉(zhuǎn)態(tài),為信號(hào)分子與靶基因結(jié)合提供空間,最終起到調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的作用。在胰島素刺激下SREBP-1c及Ch REBP介導(dǎo)的FASN轉(zhuǎn)錄激活的過程中也必然存在組蛋白修飾,但是其具體種類及機(jī)制仍不清楚。本研究對(duì)由FASN基因過度轉(zhuǎn)錄激活而導(dǎo)致的肝細(xì)胞脂肪變具有重要意義,亦為NAFLD潛在的治療靶點(diǎn)提供新的證據(jù)。鑒于此,本課題首先建立高濃度胰島素誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂肪變模型,并在此基礎(chǔ)上探討高濃度胰島素對(duì)肝細(xì)胞FASN基因啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白修飾的影響,以及FASN基因轉(zhuǎn)錄激活與這些組蛋白修飾的關(guān)系,SREBP-1c和Ch REBP對(duì)胰島素刺激下FASN基因啟動(dòng)子區(qū)組蛋白修飾的作用。最后我們深入研究了組蛋白乙�；�修飾如何影響肝細(xì)胞FASN基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá),從而導(dǎo)致肝細(xì)胞脂變的可能機(jī)制。方法:一、胰島素介導(dǎo)的FASN基因啟動(dòng)子肝細(xì)胞區(qū)組蛋白修飾、基因轉(zhuǎn)錄與肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積的關(guān)系1、胰島素刺激Hep G2和原代肝細(xì)胞的最佳濃度。按照文獻(xiàn)報(bào)道設(shè)置胰島素濃度:0.5、0.75、1.0、1.25u M分別刺激Hep G2和原代肝細(xì)胞24h,MTT檢測(cè)細(xì)胞活性。2、胰島素對(duì)肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積的影響。最佳濃度胰島素干預(yù)Hep G2細(xì)胞和原代肝細(xì)胞24和48h后用TG酶法檢測(cè)TG含量,油紅O染色檢測(cè)脂滴沉積。3、胰島素對(duì)肝細(xì)胞FASN基因轉(zhuǎn)錄及表達(dá)的影響。最佳濃度胰島素分別刺激Hep G2、原代肝細(xì)胞0、1、2、4、8、12、16、24h,或胰島素刺激Hep G2、原代肝細(xì)胞12h或4h后撤除胰島素刺激,在胰島素刺激或撤除刺激的0、1、2、4、8、12、16、24h,分別用q RT-PCR檢測(cè)FASN m RNA表達(dá),用Western-blot檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)FASN蛋白表達(dá)。4、胰島素刺激Hep G2細(xì)胞和原代肝細(xì)胞后FASN基因啟動(dòng)子區(qū)域的染色質(zhì)重塑事件。根據(jù)胰島素刺激或撤除胰島素刺激后FASN轉(zhuǎn)錄時(shí)間譜,選取FASN m RNA開始增加或者降低的時(shí)間點(diǎn)作為研究染色質(zhì)重塑的時(shí)間點(diǎn)。通過染色質(zhì)免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation,Ch IP)技術(shù),利用抗組蛋白H3K4甲基化、H3K9甲基化、H4K20甲基化、H3S10磷酸化、H3乙�；�、H4乙�；�抗體、比較胰島素作用對(duì)FASN基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)5’上游-2000bp、tss、第二外顯子(exon2)組蛋白甲基化、磷酸化、乙�；�修飾的影響。二、SREBP-1c或Ch REBP對(duì)胰島素刺激下FASN基因啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白修飾的影響1、胰島素刺激對(duì)肝細(xì)胞SREBP-1c、Ch REBP蛋白表達(dá)的影響最佳濃度胰島素刺激Hep G2和原代肝細(xì)胞0、1、2、4、8、12、16、24h,用Western-blot檢測(cè)各組細(xì)胞SREBP-1c及Ch REBP表達(dá)水平。2、胰島素刺激肝細(xì)胞后SRBEP-1c、Ch REBP核轉(zhuǎn)位最佳濃度胰島素刺激肝細(xì)胞0h、24h,免疫熒光檢測(cè)SREBP-1c、Ch REBP細(xì)胞內(nèi)定位。3、抑制肝細(xì)胞SREBP-1c或Ch REBP表達(dá)對(duì)FASN表達(dá)的影響si RNA-SREBP-1c、si RNA-Ch REBP質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Hep G2細(xì)胞,sh RNA-SREBP-1c、sh RNA-Ch REBP慢病毒轉(zhuǎn)染原代肝細(xì)胞。Western blot檢測(cè)Ch REBP、SREBP-1c以及FASN蛋白表達(dá)。4、抑制肝細(xì)胞SREBP-1c或Ch REBP表達(dá)對(duì)胰島素刺激下肝細(xì)胞SREBP-1c-SRE、Ch REBP-Ch ORE結(jié)合水平的影響si RNA-SREBP-1c、si RNA-Ch REBP質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Hep G2細(xì)胞,sh RNA-SREBP-1c、sh RNA-Ch REBP慢病毒轉(zhuǎn)染原代肝細(xì)胞。Ch IP比較空白組、陽性對(duì)照組(最佳濃度胰島素刺激)、轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染p EX3-scramble質(zhì)�；蜿幮詫�(duì)照慢病毒后用胰島素刺激)FASN基因啟動(dòng)子區(qū)域SREBP-1c-SRE、Ch REBP-Ch ORE結(jié)合水平。5、SREBP-1c和Ch REBP對(duì)胰島素刺激下肝細(xì)胞FASN基因啟動(dòng)子區(qū)組蛋白修飾的影響si RNA-SREBP-1c、si RNA-Ch REBP質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Hep G2細(xì)胞,sh RNA-SREBP-1c、sh RNA-Ch REBP慢病毒轉(zhuǎn)染原代肝細(xì)胞。Ch IP比較空白組、陽性對(duì)照組(最佳濃度胰島素刺激)、轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染p EX3-scramble質(zhì)�；蜿幮詫�(duì)照慢病毒后用胰島素刺激)FASN基因啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白修飾事件。三、組蛋白乙�；�修飾對(duì)胰島素刺激下肝細(xì)胞脂肪變性的影響Hep G2、原代肝細(xì)胞分為空白組、胰島素組(胰島素刺激Hep G2細(xì)胞12h,刺激原代肝細(xì)胞8h)、胰島素+組蛋白乙�；�酶抑制劑(Histong acetyltransrease,HAT)組。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道以及前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取5u M作為Garcionl處理肝細(xì)胞最適濃度。Ch IP檢測(cè)FASN基因啟動(dòng)子區(qū)域H3、H4乙酰化修飾以及SREBP-1c-SRE、Ch REBP-Cho RE結(jié)合水平。Western-blot檢測(cè)FASN、SREBP-1c、Ch REBP表達(dá)水平。Hep G2和原代肝細(xì)胞用胰島素刺激48h以及Garcionl與胰島素共刺激48h后油紅O檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)脂滴。結(jié)果:一、胰島素介導(dǎo)的FASN基因啟動(dòng)子肝細(xì)胞區(qū)組蛋白修飾、基因轉(zhuǎn)錄與肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積的關(guān)系1、MTT結(jié)果顯示:1.25u M為胰島素刺激Hep G2細(xì)胞和原代肝細(xì)胞最適濃度。2、Western blot結(jié)果顯示:胰島素刺激下,Hep G2細(xì)胞和原代肝細(xì)胞內(nèi)FASN蛋白水平隨著刺激時(shí)間延長(zhǎng)而表達(dá)增加(p0.05)。3、TG及油紅O測(cè)定顯示:1.25u M胰島素刺激Hep G2細(xì)胞和原代肝細(xì)胞24及48h后,肝細(xì)胞內(nèi)TG及脂滴含量均較0h明顯增加(p0.05)。證明胰島素誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪變模型構(gòu)建成功。4、q RT-PCR結(jié)果顯示:當(dāng)1.25u M胰島素刺激Hep G2細(xì)胞4h時(shí),細(xì)胞內(nèi)FASN m RNA轉(zhuǎn)錄水平較0h明顯增高,至12h時(shí),FASN m RNA轉(zhuǎn)錄水平到達(dá)峰值(P0.05)。1.25u M胰島素刺激Hep G2細(xì)胞12h時(shí)撤除胰島素刺激,在撤除胰島素刺激1h時(shí),FASN m RNA轉(zhuǎn)錄水平較0h明顯下降(P0.05)。當(dāng)1.25u M胰島素刺激原代肝細(xì)胞1h時(shí),細(xì)胞內(nèi)FASN m RNA轉(zhuǎn)錄水平較0h明顯增高,至4h時(shí),FASN m RNA轉(zhuǎn)錄水平到達(dá)峰值(P0.05)。1.25u M胰島素刺激原代肝細(xì)胞4h時(shí),撤除胰島素刺激,在撤除胰島素刺激1h時(shí),FASN m RNA轉(zhuǎn)錄水平較0h明顯下降(P0.05)。由于染色質(zhì)重塑事件一般發(fā)生在基因轉(zhuǎn)錄早期,因此我們選擇胰島素刺激Hep G2細(xì)胞4h、撤除胰島素刺激1h;胰島素刺激原代肝細(xì)胞1h、撤除胰島素刺激1h,作為研究胰島素介導(dǎo)的FASN基因啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白修飾時(shí)間的時(shí)間點(diǎn)。5、Ch IP結(jié)果顯示:胰島素分別刺激Hep G2或原代肝細(xì)胞4h或1h后,與0h相比,此時(shí)FASN m RNA轉(zhuǎn)錄出現(xiàn)明顯上調(diào),FASN基因啟動(dòng)子區(qū)域tss位點(diǎn)H3K4三甲基化、H3S10磷酸化、H3乙�；�、H4乙�；�水平顯著升高(P0.05),而H3K9三甲基化、H4K9三甲基化水平下降(P0.05)。-2kb以及exon2位點(diǎn)無明顯改變(P0.05)。胰島素分別刺激Hep G2和原代肝細(xì)胞12h和4h后撤除刺激,相比0h,在撤除刺激1h后FASN m RNA轉(zhuǎn)錄水平明顯下調(diào),FASN基因啟動(dòng)子區(qū)域tss位點(diǎn)H3K4三甲基化、H3S10磷酸化、H3乙酰化、H4乙�；�水平降低,H3K9三甲基化、H4k20三甲基化水平明顯升高(P0.05)。-2kb和exon2位點(diǎn)無明顯改變(P0.05)。二、SREBP-1c或Ch REBP對(duì)胰島素刺激下FASN基因啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白修飾的影響1、Western-blot結(jié)果顯示:胰島素刺激Hep G2或原代肝細(xì)胞后,SREBP-1c及Ch REBP蛋白水平明顯升高,且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而表達(dá)增加。在Hep G2細(xì)胞中SREBP-1c表達(dá)在8h開始升高,Ch REBP表達(dá)在4h開始升高。在原代肝細(xì)胞中SREBP-1c表達(dá)在1h開始升高,Ch REBP表達(dá)在2h開始升高。2、Western-blot結(jié)果顯示:抑制Hep G2細(xì)胞及原代肝細(xì)胞中SREBP-1c或Ch REBP表達(dá)后,即使分別再予12h及4h的胰島素刺激,SREBP-1c或Ch REBP抑制組FASN蛋白表達(dá)水平仍較胰島素刺激組明顯受抑制。說明胰島素需通過SREBP-1c或Ch REBP調(diào)控FASN的表達(dá)。3、免疫熒光結(jié)果顯示:1.25u M胰島素刺激Hep G2細(xì)胞及原代肝細(xì)胞各24h后,細(xì)胞核中的綠色熒光較正常組明顯增多,即胰島素刺激促進(jìn)SREBP-1c、Ch REBP由胞漿轉(zhuǎn)位至胞核中。4、Ch IP結(jié)果顯示:在1.25u M胰島素刺激下,抑制Hep G2和原代肝細(xì)胞SREBP-1c或Ch REBP蛋白表達(dá),與胰島素刺激組相比,FASN基因SREBP-1c-SRE、Ch REBP-Cho RE結(jié)合水平均明顯降低(p0.05)。5、Ch IP結(jié)果顯示:抑制Hep G2和原代肝細(xì)胞中SREBP-1c表達(dá),FASN基因tss、SRE位點(diǎn)H3乙�；�及H4乙酰化水平較陽性對(duì)照組明顯下降(P0.05)。而H3K4三甲基化修飾則無明顯下降。而抑制Hep G2和原代肝細(xì)胞中Ch REBP表達(dá)FASN基因tss、Ch ORE位點(diǎn)H3乙酰化及H4乙�；�水平較陽性組明顯下降(p0.05)。H3K4三甲基化同樣無明顯下降。同時(shí)抑制SREBP-1c和Ch REBP,FASN基因tss位點(diǎn)H3及H4乙�；�水平下降較單獨(dú)抑制SREBP-1c或Ch REBP下調(diào)更加明顯。結(jié)果提示FASN基因啟動(dòng)子區(qū)H3K4修飾水平并非僅受SREBP-1c和Ch REBP影響,而H3和H4乙酰化修飾水平則主要受SREBP-1c和Ch REBP影響。且SREBP-1c及Ch REBP協(xié)同參與了胰島素刺激下肝細(xì)胞FASN基因啟動(dòng)子區(qū)組蛋白修飾。三、組蛋白乙�；瘜�(duì)胰島素刺激下肝細(xì)胞脂肪變的影響1、Ch IP結(jié)果顯示:在胰島素刺激下同時(shí)抑制HAT活性,能顯著下調(diào)胰島素誘導(dǎo)的Hep G2及原代肝細(xì)胞FAS基因啟動(dòng)子區(qū)域H3、H4乙酰化水平(P0.05)。2、Ch IP結(jié)果顯示:在胰島素刺激下同時(shí)抑制HAT活性,能降低Hep G2細(xì)胞及原代肝細(xì)胞Ch REBP-Ch ORE結(jié)合水平(P0.05)。3、Western-blot結(jié)果顯示:在胰島素刺激下同時(shí)抑制HAT活性,與胰島素刺激組相比較,抑制組肝細(xì)胞FASN蛋白上調(diào)幅度明顯降低,而SREBP-1C和Ch REBP表達(dá)水平則無明顯改變。4、油紅染色顯示:在胰島素刺激下同時(shí)抑制HAT活性,細(xì)胞內(nèi)脂滴較單純胰島素刺激組減少。結(jié)論:1.25u M胰島素可誘導(dǎo)Hep G2細(xì)胞和原代肝細(xì)胞脂肪沉積。胰島素刺激能促進(jìn)FASN基因轉(zhuǎn)錄,同時(shí)伴隨FASN基因啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白H3K4三甲基化、H3S10磷酸化、H3乙酰化、H4乙�；�升高,H3K9及H4K20三甲基化水平降低,胰島素撤除后FASN基因轉(zhuǎn)錄降低,FASN基因啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白H3K4三甲基化、H3乙�；�、H4乙�；�降低,H3K9及H4K20三甲基化水平升高。胰島素通過調(diào)控SREBP-1c以及Ch REBP表達(dá)來影響FASN基因轉(zhuǎn)錄表達(dá),而SREBP-1c或Ch REBP則通過增強(qiáng)與FASN基因啟動(dòng)子調(diào)控區(qū)域SRE或Ch ORE結(jié)合并誘導(dǎo)FASN基因H3、H4乙酰化,發(fā)揮對(duì)FASN基因的調(diào)控作用。在胰島素作用下,Garcinol抑制HAT活性并不能抑制SREBP-1c或Ch REBP的表達(dá),而是通過干擾SREBP-1c和Ch REBP與FASN基因啟動(dòng)子區(qū)域SRE、Ch ORE結(jié)合,降低其轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)而干擾FASN蛋白的表達(dá)。說明組蛋白乙�；�修飾是胰島素刺激下SREBP-1c及Ch REBP介導(dǎo)的FASN轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要機(jī)制之一。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R575

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3 許斌;鴨原代肝細(xì)胞對(duì)鴨乙型肝炎病毒易感性相關(guān)蛋白的研究[D];復(fù)旦大學(xué);2006年

4 黃屹;乙型肝炎病毒在原代肝細(xì)胞共培養(yǎng)模型上的增強(qiáng)感染研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2013年

5 劉振威;健康成人原代肝細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)測(cè)定異煙肼和利福平的肝代謝和肝毒性的研究[D];復(fù)旦大學(xué);2004年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 覃玉燕;成人原代肝細(xì)胞的分離、鑒定及其蛋白質(zhì)合成與P450表達(dá)[D];湖南師范大學(xué);2015年

2 陳亮;成人原代肝細(xì)胞培養(yǎng)及凍存復(fù)蘇后細(xì)胞凋亡的Annexin V/PI檢測(cè)及Fas表達(dá)[D];湖南師范大學(xué);2015年

3 肖燕;乙酰甲喹及其代謝物的抑菌活性和對(duì)雞原代肝細(xì)胞毒性的研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

4 孫珍珍;同型半胱氨酸通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激致肝脂質(zhì)蓄積作用[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2015年

5 史曉麗;VNN1調(diào)節(jié)炎癥狀態(tài)下的肝臟Hepcidin表達(dá)及肝鐵紊亂的分子機(jī)制[D];南京師范大學(xué);2015年

6 李曼;2D、3D培養(yǎng)的大鼠原代肝細(xì)胞和BRL-3A細(xì)胞在藥物肝毒性評(píng)價(jià)中的比較研究[D];廣東藥科大學(xué);2016年

7 徐菁;雛鴨原代肝細(xì)胞培養(yǎng)及DHAV-1致肝細(xì)胞損傷的研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

8 彭孟云;基于P38MAPK信號(hào)通路探討祛痰活血顆粒含藥血清調(diào)節(jié)NAFLD大鼠原代肝細(xì)胞AQP9表達(dá)的作用機(jī)制[D];西南醫(yī)科大學(xué);2016年

9 張優(yōu)敬;硫化氫對(duì)小鼠原代肝細(xì)胞脂肪合成和分解的影響[D];河南大學(xué);2015年

10 蔣麗娜;HCVcore蛋白誘發(fā)肝脂肪變機(jī)制的初步研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2011年

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本文編號(hào)：1545251