發(fā)布時(shí)間：2018-02-27 10:45

  本文關(guān)鍵詞： 乙型肝炎病毒 肝纖維化 轉(zhuǎn)錄組學(xué) 蛋白質(zhì)組學(xué)　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景:肝纖維化(Liver fibrosis)是一種世界范圍內(nèi)的高發(fā)病率與高死亡率的肝臟疾病,由于肝纖維化具有可逆性,針對(duì)肝纖維化的研究已成為近年來肝臟疾病研究的熱點(diǎn)。乙型肝炎病毒(HepatitisB virus,HBV)感染是引起肝纖維化的重要因素之一。但是,HBV持續(xù)性感染引起的肝纖維化的機(jī)制仍未明確。因此,進(jìn)一步闡述HBV相關(guān)肝纖維化的分子機(jī)制,對(duì)于診斷和治療具有重要的意義。目前,蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)在肝臟及其相關(guān)疾病研究中得到了廣泛的應(yīng)用。應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法,已經(jīng)鑒定到了一系列與肝纖維化相關(guān)的分子標(biāo)志物,肝纖維化的機(jī)制也被不斷完善。高通量測(cè)序技術(shù)(RNA-Seq)也被廣泛應(yīng)用于疾病發(fā)病機(jī)制的研究以及分子標(biāo)志物的篩選等方面。但是,將RNA-Seq技術(shù)應(yīng)用于HBV相關(guān)肝纖維化發(fā)病機(jī)制研究的報(bào)道尚少。因此,綜合利用高通量的蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法,研究肝纖維化過程中基因和蛋白質(zhì)的變化,將有助于發(fā)現(xiàn)新的潛在的分子標(biāo)志物,并進(jìn)一步闡述肝纖維化的分子機(jī)制。研究目的:1、應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法,分析HBV持續(xù)性復(fù)制并伴有肝纖維化的模型小鼠肝臟組織中蛋白質(zhì)的表達(dá)變化,鑒定出與肝纖維化相關(guān)的差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。2、應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法,分析HBV持續(xù)性復(fù)制并伴有肝纖維化的模型小鼠肝臟組織中基因的轉(zhuǎn)錄變化,鑒定出與肝纖維化相關(guān)的差異轉(zhuǎn)錄的基因。3、運(yùn)用生物信息學(xué)方法綜合分析蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù),進(jìn)一步闡述HBV相關(guān)的肝纖維化的分子機(jī)制。實(shí)驗(yàn)方法:1、將AAV8-1.2HBV重組病毒尾靜脈注射C57BL/6小鼠。在AAV8-1.2HBV重組病毒注射后的不同時(shí)間點(diǎn)采集小鼠血液及肝臟組織樣本,檢測(cè)血清和肝組織中HBV DNA以及肝纖維化相關(guān)指標(biāo)的變化,通過免疫組織化學(xué)染色等方法分析模型小鼠肝組織的病理變化及肝纖維化進(jìn)程。2、在AAV8-1.2HBV重組病毒注射后的1、3、6個(gè)月,對(duì)小鼠肝臟組織總蛋白質(zhì)進(jìn)行二維凝膠電泳分析。經(jīng)過圖像分析后,采集差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn),進(jìn)行MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜鑒定;對(duì)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行g(shù)ene ontology、KEGG pathway以及蛋白與蛋白相互作用分析。3、在AAV8-1.2HBV重組病毒注射后的1、3、6個(gè)月,采集小鼠肝臟組織樣本并提取總RNA、構(gòu)建cDNA文庫。使用2x150bp配對(duì)末端構(gòu)型進(jìn)行測(cè)序并與參考基因組比對(duì)。測(cè)序結(jié)果進(jìn)行基因表達(dá)水平分析,獲得差異基因,并進(jìn)行g(shù)ene ontology、KEGG pathway以及蛋白與蛋白相互作用分析。4、綜合分析轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果,找到重疊的差異表達(dá)的蛋白質(zhì),并進(jìn)行DAVID聚類分析以及Western Blot和RT-qPCR驗(yàn)證。通過生物信息學(xué)分析,進(jìn)一步闡述HBV相關(guān)肝纖維化的機(jī)制。在HSC LX-2細(xì)胞系中,應(yīng)用RT-qPCR和siRNA技術(shù)對(duì)炎癥相關(guān)基因Nlrp1進(jìn)行初步的研究。結(jié)果:1、AAV8-1.2HBV重組病毒注射后的1～6個(gè)月,小鼠的肝臟組織和血清中均可以檢測(cè)出較高濃度的HBVDNA,模型小鼠表現(xiàn)出病毒血癥。病理切片及肝纖維化指標(biāo)檢測(cè)顯示,小鼠肝組織沒有明顯的急性炎癥反應(yīng),但是出現(xiàn)了慢性炎癥反應(yīng)和肝臟脂肪變性,HBsAg和HBeAg積累,肝組織形成了肝纖維化。2、通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析,鑒定出173個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。生物信息學(xué)分析表明,差異表達(dá)的蛋白質(zhì)主要定位于細(xì)胞的線粒體,參與了 Reactive oxygen species、ATP的合成等生物過程,并且被富集在NOD-like receptor signaling pathway、RIG-I-like receptor signaling pathway 以及 apoptosis 等信號(hào)通路中。蛋白與蛋白相互作用結(jié)果顯示,差異表達(dá)的蛋白在氨基酸代謝,免疫調(diào)節(jié)和氧化應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮作用。3、通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析,共鑒定到213個(gè)一致上調(diào)轉(zhuǎn)錄的基因以及109個(gè)下調(diào)轉(zhuǎn)錄的基因。生物信息學(xué)分析表明,一致上調(diào)轉(zhuǎn)錄的基因主要參與酸代謝,被富集到了細(xì)胞外組分中,并且參與了 Drug metabolism-cytochrome P450等信號(hào)通路;一致下調(diào)的基因主要參與了脂質(zhì)代謝,并且被富集到過氧化物酶體及微體中,主要參與了脂肪細(xì)胞因子等信號(hào)通路;蛋白與蛋白相互作用結(jié)果顯示,PI3K/AKT、JaK/STAT等信號(hào)通路異常。4、將差異表達(dá)的蛋白與差異轉(zhuǎn)錄的基因進(jìn)行匹配分析,發(fā)現(xiàn)28個(gè)重疊的差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。28個(gè)重疊的蛋白高度富集到谷胱甘肽代謝、氧化還原反應(yīng)、天然免疫以及Wnt信號(hào)通路中。參與氧化壓力調(diào)控的蛋白質(zhì)CAT、GSTP1、PRDX1、NXN、BLVRB以及IDH1的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)均發(fā)生了明顯的改變。上述蛋白質(zhì)可能通過泛素化修飾來調(diào)節(jié)其活性,特別是UBC可能是重要的調(diào)節(jié)蛋白。在HSCLX2細(xì)胞系中,沉默Nlrp1能夠抑制TGF-β1的表達(dá)。結(jié)論:1、本研究建立了乙型肝炎病毒持續(xù)性復(fù)制并伴有肝纖維化的小鼠模型,該模型表現(xiàn)出病毒血癥、慢性炎癥以及肝臟的脂肪變性和肝纖維化,與人乙型肝炎病毒慢性感染所引起的肝纖維化更為接近,為慢性乙型肝炎相關(guān)的肝纖維化機(jī)制的研究提供了良好的動(dòng)物模型。2、本研究應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法,從蛋白質(zhì)和RNA兩個(gè)水平對(duì)HBV相關(guān)肝纖維化的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了分析,揭示了氧化壓力在肝纖維化生成過程中的重要作用,以及CAT、BLVRB、NXN、PRDX1以及IDH1對(duì)氧化壓力的調(diào)控作用。這一結(jié)果為深入理解HBV相關(guān)肝纖維化的發(fā)生發(fā)展機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。3、在肝纖維化機(jī)制的初步研究,應(yīng)用siRNA沉默Nlrp1能夠抑制TGF-β1的表達(dá)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R512.62;R575.2

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本文編號(hào)：1542342