發(fā)布時間：2018-02-27 10:45

  本文關鍵詞： 乙型肝炎病毒 肝纖維化 轉錄組學 蛋白質組學　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學院》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：研究背景:肝纖維化(Liver fibrosis)是一種世界范圍內的高發(fā)病率與高死亡率的肝臟疾病,由于肝纖維化具有可逆性,針對肝纖維化的研究已成為近年來肝臟疾病研究的熱點。乙型肝炎病毒(HepatitisB virus,HBV)感染是引起肝纖維化的重要因素之一。但是,HBV持續(xù)性感染引起的肝纖維化的機制仍未明確。因此,進一步闡述HBV相關肝纖維化的分子機制,對于診斷和治療具有重要的意義。目前,蛋白質組學和轉錄組學在肝臟及其相關疾病研究中得到了廣泛的應用。應用蛋白質組學方法,已經(jīng)鑒定到了一系列與肝纖維化相關的分子標志物,肝纖維化的機制也被不斷完善。高通量測序技術(RNA-Seq)也被廣泛應用于疾病發(fā)病機制的研究以及分子標志物的篩選等方面。但是,將RNA-Seq技術應用于HBV相關肝纖維化發(fā)病機制研究的報道尚少。因此,綜合利用高通量的蛋白質組學和轉錄組學方法,研究肝纖維化過程中基因和蛋白質的變化,將有助于發(fā)現(xiàn)新的潛在的分子標志物,并進一步闡述肝纖維化的分子機制。研究目的:1、應用蛋白質組學方法,分析HBV持續(xù)性復制并伴有肝纖維化的模型小鼠肝臟組織中蛋白質的表達變化,鑒定出與肝纖維化相關的差異表達的蛋白質。2、應用轉錄組學方法,分析HBV持續(xù)性復制并伴有肝纖維化的模型小鼠肝臟組織中基因的轉錄變化,鑒定出與肝纖維化相關的差異轉錄的基因。3、運用生物信息學方法綜合分析蛋白質組學和轉錄組學數(shù)據(jù),進一步闡述HBV相關的肝纖維化的分子機制。實驗方法:1、將AAV8-1.2HBV重組病毒尾靜脈注射C57BL/6小鼠。在AAV8-1.2HBV重組病毒注射后的不同時間點采集小鼠血液及肝臟組織樣本,檢測血清和肝組織中HBV DNA以及肝纖維化相關指標的變化,通過免疫組織化學染色等方法分析模型小鼠肝組織的病理變化及肝纖維化進程。2、在AAV8-1.2HBV重組病毒注射后的1、3、6個月,對小鼠肝臟組織總蛋白質進行二維凝膠電泳分析。經(jīng)過圖像分析后,采集差異表達的蛋白質點,進行MALDI-TOF/TOF質譜鑒定;對差異表達的蛋白質進行gene ontology、KEGG pathway以及蛋白與蛋白相互作用分析。3、在AAV8-1.2HBV重組病毒注射后的1、3、6個月,采集小鼠肝臟組織樣本并提取總RNA、構建cDNA文庫。使用2x150bp配對末端構型進行測序并與參考基因組比對。測序結果進行基因表達水平分析,獲得差異基因,并進行gene ontology、KEGG pathway以及蛋白與蛋白相互作用分析。4、綜合分析轉錄組學和蛋白質組學結果,找到重疊的差異表達的蛋白質,并進行DAVID聚類分析以及Western Blot和RT-qPCR驗證。通過生物信息學分析,進一步闡述HBV相關肝纖維化的機制。在HSC LX-2細胞系中,應用RT-qPCR和siRNA技術對炎癥相關基因Nlrp1進行初步的研究。結果:1、AAV8-1.2HBV重組病毒注射后的1～6個月,小鼠的肝臟組織和血清中均可以檢測出較高濃度的HBVDNA,模型小鼠表現(xiàn)出病毒血癥。病理切片及肝纖維化指標檢測顯示,小鼠肝組織沒有明顯的急性炎癥反應,但是出現(xiàn)了慢性炎癥反應和肝臟脂肪變性,HBsAg和HBeAg積累,肝組織形成了肝纖維化。2、通過蛋白質組學分析,鑒定出173個差異表達的蛋白質。生物信息學分析表明,差異表達的蛋白質主要定位于細胞的線粒體,參與了 Reactive oxygen species、ATP的合成等生物過程,并且被富集在NOD-like receptor signaling pathway、RIG-I-like receptor signaling pathway 以及 apoptosis 等信號通路中。蛋白與蛋白相互作用結果顯示,差異表達的蛋白在氨基酸代謝,免疫調節(jié)和氧化應激反應中發(fā)揮作用。3、通過轉錄組學分析,共鑒定到213個一致上調轉錄的基因以及109個下調轉錄的基因。生物信息學分析表明,一致上調轉錄的基因主要參與酸代謝,被富集到了細胞外組分中,并且參與了 Drug metabolism-cytochrome P450等信號通路;一致下調的基因主要參與了脂質代謝,并且被富集到過氧化物酶體及微體中,主要參與了脂肪細胞因子等信號通路;蛋白與蛋白相互作用結果顯示,PI3K/AKT、JaK/STAT等信號通路異常。4、將差異表達的蛋白與差異轉錄的基因進行匹配分析,發(fā)現(xiàn)28個重疊的差異表達的蛋白質。28個重疊的蛋白高度富集到谷胱甘肽代謝、氧化還原反應、天然免疫以及Wnt信號通路中。參與氧化壓力調控的蛋白質CAT、GSTP1、PRDX1、NXN、BLVRB以及IDH1的轉錄和表達均發(fā)生了明顯的改變。上述蛋白質可能通過泛素化修飾來調節(jié)其活性,特別是UBC可能是重要的調節(jié)蛋白。在HSCLX2細胞系中,沉默Nlrp1能夠抑制TGF-β1的表達。結論:1、本研究建立了乙型肝炎病毒持續(xù)性復制并伴有肝纖維化的小鼠模型,該模型表現(xiàn)出病毒血癥、慢性炎癥以及肝臟的脂肪變性和肝纖維化,與人乙型肝炎病毒慢性感染所引起的肝纖維化更為接近,為慢性乙型肝炎相關的肝纖維化機制的研究提供了良好的動物模型。2、本研究應用蛋白質組學和轉錄組學方法,從蛋白質和RNA兩個水平對HBV相關肝纖維化的發(fā)病機制進行了分析,揭示了氧化壓力在肝纖維化生成過程中的重要作用,以及CAT、BLVRB、NXN、PRDX1以及IDH1對氧化壓力的調控作用。這一結果為深入理解HBV相關肝纖維化的發(fā)生發(fā)展機制奠定了基礎。3、在肝纖維化機制的初步研究,應用siRNA沉默Nlrp1能夠抑制TGF-β1的表達。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R512.62;R575.2

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