發(fā)布時(shí)間：2020-11-09 07:03

　　 目的:驗(yàn)證慢病毒介導(dǎo)hBMP-2和hVEGF-165雙基因轉(zhuǎn)染(兩次轉(zhuǎn)染)BMSCs的可行性和轉(zhuǎn)染后BMSCs更良好的誘導(dǎo)成骨性能。方法:分離提取兔BMSCs,流式細(xì)胞儀鑒定;將攜帶hBMP-2基因的慢病毒轉(zhuǎn)染第三代兔BMSCs,細(xì)胞倍增后,一半作為單基因轉(zhuǎn)染組,一半用攜帶hVEGF-165基因的慢病毒再次轉(zhuǎn)染,熒光顯微鏡下觀察。至此,BMSCs分為4組,A組為未轉(zhuǎn)染組、B組為兩次轉(zhuǎn)染熒光蛋白基因的空載組、C組為BMP2單基因轉(zhuǎn)染組、D組為hBMP-2和hVEGF-165雙基因轉(zhuǎn)染組;轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)Western Blot檢測(cè)目的蛋白表達(dá)及變化,MTT檢測(cè)各組細(xì)胞增殖活性,轉(zhuǎn)染后14d檢測(cè)各組堿性磷酸酶活性。轉(zhuǎn)染后經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)6周,茜素紅染色檢測(cè)骨結(jié)節(jié)。結(jié)果:1.B、C、D組轉(zhuǎn)后染熒光顯微鏡下均可見相應(yīng)的綠色及紅色熒光蛋白表達(dá)。轉(zhuǎn)染后3d C、D組均有相應(yīng)目的蛋白高表達(dá),轉(zhuǎn)染后7d、14d、21d,目的蛋白檢測(cè)無明顯變化(p0.05);2.細(xì)胞增殖檢測(cè)可見D組增殖稍快于C組(p0.05),C組又明顯快于A、B組(p0.05),A、B組細(xì)胞增殖曲線的走行方向基本一致(p0.05);3.A、B組堿性磷酸酶染色僅約5%細(xì)胞被深染,C組為80%、D組為90%。C、D組ALP活力明顯高于A、B組,D組高于C組約1/5。4.C組茜素紅染色出的骨結(jié)節(jié)數(shù)量明顯多于A、B組,D組骨結(jié)節(jié)數(shù)量比C組稍多且大。結(jié)論:慢病毒介導(dǎo)的hBMP-2和hVEGF-165雙基因經(jīng)兩次轉(zhuǎn)染能成功轉(zhuǎn)入兔BMSCs內(nèi),并長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá),該雙因子的表達(dá)能刺激細(xì)胞堿性磷酸酶生成,促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞更好的向成骨細(xì)胞分化。
【學(xué)位單位】：桂林醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R68;R318.08
【部分圖文】：

圖 1 原代 BMSCs 傳代后細(xì)胞分布均勻，排列呈漩渦狀、魚群狀，細(xì)胞呈短梭形、三角形。Figure 1 The cell morphology of the 3 th generation of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells (×100)

圖 2 首次轉(zhuǎn)染第 7 天，即第二次轉(zhuǎn)染后第 4 天，實(shí)驗(yàn)組和空載組細(xì)胞在熒光顯微鏡下均見到綠色和紅色熒光表達(dá)，熒光下細(xì)胞形態(tài)未見明顯改變，綜合轉(zhuǎn)染率可達(dá) 95%以上。

圖 3 雙基因轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染后 3 日 western blot 檢測(cè)目的蛋白。Figure 3 Double-gene transfection group was detected by western b
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 石正松;李強(qiáng);蔡偉良;寧寅寬;李詩(shī)鵬;;腺病毒介導(dǎo)hBMP-2轉(zhuǎn)染BMSCs復(fù)合DBM修復(fù)兔缺血性股骨頭壞死的實(shí)驗(yàn)研究[J];天津醫(yī)藥;2015年10期

2 寧寅寬;李強(qiáng);蔡偉良;武成聰;陳佳濱;石正松;;Ad-BMP-2/GFP轉(zhuǎn)染兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞前后生物學(xué)特性的研究[J];中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志;2014年12期

3 李耀華;;大塊血管化組織工程骨修復(fù)的骨缺損[J];中國(guó)組織工程研究;2014年07期

本文編號(hào)：2876068