發(fā)布時(shí)間：2020-11-04 21:18

　　 目前,癌癥已成為我國(guó)居民死亡的主要原因之一,是嚴(yán)重危害我國(guó)居民健康的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題。近年來(lái),隨著個(gè)體化醫(yī)療的不斷發(fā)展,根據(jù)腫瘤患者的基因突變信息為患者制定個(gè)性化治療方案的“精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)”模式在臨床腫瘤患者的治療當(dāng)中發(fā)揮著日益重要的作用。大量的腫瘤基因突變?cè)诎┌Y患者的診斷、治療及預(yù)后判斷中的臨床應(yīng)用價(jià)值已被證實(shí)。由于越來(lái)越多的腫瘤基因突變位點(diǎn)不斷被發(fā)現(xiàn),傳統(tǒng)的單個(gè)位點(diǎn)的基因檢測(cè)方法已不能滿(mǎn)足臨床需求。高通量測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn),使得多個(gè)基因的多個(gè)位點(diǎn)同時(shí)檢測(cè)成為可能。高通量測(cè)序較傳統(tǒng)的分子檢測(cè)方法要復(fù)雜得多,既包括核酸提取、序列靶向富集、文庫(kù)制備和測(cè)序等含多個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟的“濕實(shí)驗(yàn)”過(guò)程,還有包含測(cè)序后的數(shù)據(jù)質(zhì)量分析、參考序列比對(duì)、變異識(shí)別、注釋和結(jié)果報(bào)告解讀等步驟的生物信息學(xué)分析流程(即“干實(shí)驗(yàn)”過(guò)程),生物信息學(xué)分析流程對(duì)于高通量測(cè)序檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性與“濕實(shí)驗(yàn)”一樣具有決定性意義。對(duì)于臨床高通量測(cè)序檢測(cè)的生物信息學(xué)分析,要想獲得準(zhǔn)確可靠的生物信息學(xué)分析結(jié)果,就需要選擇合適的參考物質(zhì)(Reference material,RM),也稱(chēng)為參考數(shù)據(jù)(Reference dataset)對(duì)生物信息學(xué)分析流程進(jìn)行優(yōu)化、性能確認(rèn)、室內(nèi)質(zhì)量控制(Internal Quality Control,IQC)以及定期開(kāi)展室間質(zhì)量評(píng)價(jià)(External Quality Assessment,EQA)。通過(guò)使用臨床樣本或腫瘤細(xì)胞系DNA等制備的參考數(shù)據(jù)雖然可以用于生物信息學(xué)分析流程的優(yōu)化、性能確認(rèn)、室內(nèi)質(zhì)量控制及室間質(zhì)量評(píng)價(jià),但其制備較為繁瑣,成本較高,且無(wú)法包含所有的突變類(lèi)型�；�于測(cè)序數(shù)據(jù)編輯的計(jì)算機(jī)模擬方法制備的生物信息分析參考數(shù)據(jù),具有制備簡(jiǎn)單、快速、成本低且不受突變類(lèi)型的限制等優(yōu)點(diǎn)。但目前已有的基于測(cè)序數(shù)據(jù)編輯的生物信息學(xué)分析參考數(shù)據(jù)模擬軟件BAMSurgeon僅能對(duì)單核苷酸變異及短片段插入/缺失變異有較好的模擬效果,而不能模擬拷貝數(shù)變異、多核苷酸變異等復(fù)雜變異,并且不能對(duì)靶向測(cè)序數(shù)據(jù)的大片段結(jié)構(gòu)變異進(jìn)行模擬。此外,BAMSurgeon也不能對(duì)Ion Torrent測(cè)序平臺(tái)的數(shù)據(jù)進(jìn)行模擬。因此,缺少合適的生物信息學(xué)分析參考數(shù)據(jù)對(duì)不同臨床實(shí)驗(yàn)室的生物信息學(xué)分析流程進(jìn)行全面的性能評(píng)估。本研究中,我們開(kāi)發(fā)了一款基于測(cè)序數(shù)據(jù)編輯的生物信息學(xué)分析參考數(shù)據(jù)模擬軟件——VarBen。為驗(yàn)證VarBen軟件制備的體細(xì)胞突變生物信息學(xué)分析參考數(shù)據(jù)是否可以模擬真實(shí)腫瘤樣本中的體細(xì)胞突變,我們將含有真實(shí)體細(xì)胞突變的腫瘤樣本測(cè)序數(shù)據(jù)與VarBen和BAMSurgeon軟件制備的體細(xì)胞突變生物信息學(xué)分析參考數(shù)據(jù)進(jìn)行了比較。結(jié)果表明,相比于BAMSurgeon,VarBen模擬體細(xì)胞突變的檢出效果與腫瘤樣本測(cè)序數(shù)據(jù)中真實(shí)體細(xì)胞突變(MB gold set)的檢出效果更加相近,這一結(jié)果證明VarBen制備的生物信息學(xué)分析參考數(shù)據(jù)可模擬出接近真實(shí)腫瘤樣本測(cè)序數(shù)據(jù)的體細(xì)胞突變。同時(shí)為驗(yàn)證VarBen軟件的可靠性和穩(wěn)定性,我們?cè)u(píng)估了原始測(cè)序數(shù)據(jù)基因組背景、比對(duì)軟件的使用以及測(cè)序reads分割是否會(huì)對(duì)VarBen產(chǎn)生影響。結(jié)果證明原始測(cè)序數(shù)據(jù)的基因組背景、使用的比對(duì)軟件以及原始測(cè)序reads分割不會(huì)對(duì)VarBen軟件體細(xì)胞突變的模擬產(chǎn)生影響。綜上,我們的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證明了 VarBen軟件的可靠性和穩(wěn)定性,且其制備的模擬測(cè)序數(shù)據(jù)可用作臨床體細(xì)胞突變檢測(cè)生物信息學(xué)分析參考數(shù)據(jù)。為全面評(píng)估臨床實(shí)驗(yàn)室腫瘤體細(xì)胞突變生物信息分析能力,我們使用VarBen制備的生物信息學(xué)分析參考數(shù)據(jù)開(kāi)展了腫瘤體細(xì)胞基因突變高通量測(cè)序檢測(cè)生物信息學(xué)分析室間質(zhì)量評(píng)價(jià)調(diào)研活動(dòng)。我們共收到實(shí)驗(yàn)室提交的113個(gè)有效分析結(jié)果,實(shí)驗(yàn)室提交結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析顯示,相對(duì)于單核苷酸變異,目前臨床實(shí)驗(yàn)室對(duì)短片段插入/缺失變異的生物信息學(xué)分析能力還有待提高,尤其是復(fù)雜插入-缺失變異和FLT基因內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)(internal tandem duplication,ITD)。實(shí)驗(yàn)室在建立高通量測(cè)序基因突變檢測(cè)生物信息學(xué)分析流程的過(guò)程中,需充分重視對(duì)生物信息學(xué)分析流程的性能確認(rèn),以保證分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。此外,本次室間質(zhì)評(píng)也證明了 VarBen制備生物信息學(xué)分析參考數(shù)據(jù)的實(shí)用性。綜上所述,本研究開(kāi)發(fā)了一款基于測(cè)序數(shù)據(jù)編輯的生物信息學(xué)分析參考數(shù)據(jù)模擬軟件—VarBen。與目前已有模擬軟件相比,VarBen解決了目前無(wú)法對(duì)拷貝數(shù)變異、多核苷酸變異、復(fù)雜插入-缺失變異等復(fù)雜變異以及靶向測(cè)序數(shù)據(jù)的大片段結(jié)構(gòu)變異進(jìn)行模擬的難題,且同時(shí)適用于Illumina測(cè)序平臺(tái)、華大BGI測(cè)序平臺(tái)和Ion torrent測(cè)序平臺(tái)�；�于測(cè)序數(shù)據(jù)編輯的方法可保留高通量測(cè)序“濕實(shí)驗(yàn)”部分文庫(kù)制備及上機(jī)測(cè)序過(guò)程中產(chǎn)生的背景錯(cuò)誤分布模式,從而保證模擬數(shù)據(jù)更加的接近臨床真實(shí)測(cè)序數(shù)據(jù),同時(shí)可對(duì)任意類(lèi)型的突變位點(diǎn)進(jìn)行模擬,具有制備成本低、快速、可靠等優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)使用VarBen制備個(gè)性化的生物信息學(xué)分析參考數(shù)據(jù)可幫助臨床實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)其生物信息學(xué)分析流程中存在的問(wèn)題,從而幫助臨床實(shí)驗(yàn)室提高基因突變檢測(cè)的準(zhǔn)確性。
【學(xué)位單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：Q811.4;R730.5
【部分圖文】：

“Ｇ”四個(gè)堿基的流動(dòng)順序即可計(jì)算出ＤＮＡ的堿基序列信息。雖然各個(gè)平臺(tái)??都有自己不同的測(cè)序原理，但其測(cè)序的基本流程比較相近，根據(jù)實(shí)驗(yàn)流程的不同，??高通量測(cè)序基因檢測(cè)主要分為兩個(gè)部分（圖１）：?１）實(shí)驗(yàn)操作部分，又稱(chēng)為“濕實(shí)驗(yàn)”??（ｗｅｔ－ｂｅｎｃｈ?ｐａｒｔ?ｏｆ?ＮＧＳ?）；包括樣本的米集、ＤＮＡ的提取、加入分子標(biāo)簽（ｂａｒｃｏｄｅ?）、??目標(biāo)區(qū)域靶向富集（基于ＰＣＲ的擴(kuò)增子靶向捕獲技術(shù)或基于核酸雜交的探針捕獲??技術(shù)）、測(cè)序文庫(kù)制備、上機(jī)測(cè)序、測(cè)序數(shù)據(jù)的生成。２）生物信息學(xué)分析部分，該??過(guò)程又稱(chēng)為？？干實(shí)驗(yàn)”（ｄｒｙ－ｂｅｎｃｈ?ｐａｒｔ?ｏｆ?ＮＧＳ）；通過(guò)高性能的計(jì)算機(jī)和不同的生物??信息分析軟件的組合建立生物信息分析流程（Ｂｉｏｉｎｆｏｍｉａｔｉｃｓ?ｐｉｐｅｌｉｎｅ?），主要步驟包??括：原始數(shù)據(jù)質(zhì)控、參考序列比對(duì)、變異識(shí)別、注釋和臨床報(bào)告解讀等。??腫瘤組織標(biāo)本?正常配對(duì)樣本??????－１??■Ｉ?＿??Ｓａｍｐｌｅ?ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ?ａｎｄ?ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ?汽?ｉ甬暈測(cè)序??ｒ…—．＇

ｇ．ｏｗ?ｃａｏｕｍｏｒ?ｇｅｎｏｍｅ?ｓｍｕａｏｎｙａｒｅｎ??根據(jù)目前國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀，測(cè)序數(shù)據(jù)編輯（Ｒｅａｄｓｅｄｉｔｉｎｇ）策略是目前模擬臨床??生物信息學(xué)分析流程參考數(shù)據(jù)的最佳方案。因此，我們選取了測(cè)序數(shù)據(jù)編輯策略并??確定了測(cè)序數(shù)據(jù)的編輯流程（圖３）：??１）首先將測(cè)序完成后的原始測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)到參考基因組，獲得比對(duì)后的測(cè)序??數(shù)據(jù)（ＢＡＭ文件），經(jīng)過(guò)參考基因組比對(duì)完成之后的每一條ｒｅａｄ可獲得其??在參考基因組上的坐標(biāo)信息。??２）提供一個(gè)需要模擬的突變列表，根據(jù)提供的突變列表信息將需要進(jìn)行編輯??的ｒｅａｄｓ挑選出來(lái)。突變列表包含的信息主要包括：突變位點(diǎn)的位置（染色??體起始和終止位點(diǎn)）、目標(biāo)突變頻率、突變類(lèi)型以及突變的堿基。??３）根據(jù)突變列表提供的突變類(lèi)型、突變頻率以及突變的堿基類(lèi)型對(duì)選取的??ｒｅａｄｓ進(jìn)行相應(yīng)的編輯。??４）將編輯后的測(cè)序ｒｅａｄｓ重新比對(duì)到參考基因組以獲取編輯之后正確的比對(duì)信??息，隨后與未編輯的原始測(cè)序ｒｅａｄｓ進(jìn)行合并，最終得到含有特定突變位點(diǎn)??的模擬腫瘤測(cè)序樣本。??

Ａｌｔ??ｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓ?？?Ａｌｔ．?■丨■—?＾??串聯(lián)重復(fù)?倒位??Ｅ?Ｆ??Ｒｅｆ．?ｅｚ￥－￣？?－．?ｍｍ?？?Ｒｅｆ．?ｍｚｍ－?？??？??Ａｌｔ．??ｍｒｍ￣—？?—￣ｍｚｍ?？?Ａｌｔ．??ｍｒｍ?？?一￣＿：ｊｉ?？??平衡易位?非平衡易位??Ｇ??染色體全臂易位??圖６結(jié)構(gòu)變異的不同類(lèi)型??Ｆｉｇ．?６?Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｔｙｐｅｓ?ｏｆ?ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ?ｖａｒｉａｎｔｓ??Ａ：大片段缺失；Ｂ：外源ＤＮＡ插入；Ｃ：串聯(lián)重復(fù)；Ｄ：倒位；Ｅ：平衡易位；??Ｆ：非平衡易位；Ｇ：染色體全臂易位??
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