發(fā)布時(shí)間：2020-11-20 19:59

　　 單純皰疹病毒（HSV）屬于皰疹病毒科中的α皰疹病毒亞科，是人類(lèi) 多種疾病的病原體。在HSV的復(fù)制過(guò)程中，核衣殼的組裝是在細(xì)胞核內(nèi)完 成的。但對(duì)于核衣殼如何獲得被膜和囊膜，目前尚有爭(zhēng)論。一種意見(jiàn)認(rèn)為， 核衣殼在細(xì)胞核內(nèi)獲得被膜，并通過(guò)出芽在內(nèi)層核膜處獲得其囊膜后，進(jìn) 入核周間隙，進(jìn)一步經(jīng)與核周間隙相連接的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，以囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)的方式經(jīng) 高爾基體到達(dá)細(xì)胞膜，囊泡膜與細(xì)胞膜融合，病毒顆粒釋放到細(xì)胞外。另 一種意見(jiàn)則認(rèn)為，核衣亮在內(nèi)層核膜處獲得的囊膜是臨時(shí)性的囊膜，這層 囊膜與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜融合后，脫囊膜的核衣殼至胞漿中。裸露的核衣殼在胞漿 中的膜性區(qū)室——很可能是分泌面高爾基體網(wǎng)絡(luò)（TGN）——以出芽的方 式獲得其囊膜，這個(gè)過(guò)程稱(chēng)為重包裹。最近的多項(xiàng)研究支持第二種觀(guān)點(diǎn)。 如果HSV確實(shí)是在胞漿中的膜性區(qū)室以出芽的方式獲得其囊膜，那么，HSV 的囊膜糖蛋白及某些被膜蛋白，必須在該膜性區(qū)室的膜上聚集，以使HSV 在獲得囊膜的脂質(zhì)雙層的同時(shí)，獲得被膜蛋白及囊膜糖蛋白。已知多種α 皰疹病毒糖蛋白E在細(xì)胞內(nèi)定位于TGN，其定位的機(jī)制很可能是通過(guò)糖蛋 白E胞漿區(qū)酸性氨基酸簇與磷酸弗林蛋白酶酸性氨基酸簇分選蛋白1 （Phosphofurin acidic cluster sorting protein 1，PACS-1）的相互作用。本研 究的目的即在于闡明除糖蛋白E外，還有哪些HSV的蛋白質(zhì)定位于TGN， 它們的定位機(jī)制是什么，PACS-1在這些蛋白質(zhì)定位于TGN中有何作用， 以及進(jìn)一步闡明PACS-1在皰疹病毒發(fā)生中的作用。 首先我們根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的與PACS-1結(jié)合的酸性氨基酸簇的特點(diǎn)，采用 序列分析的方法，以已完成全基因組測(cè)序的HSV-1 17株作為分析對(duì)象，從 其蛋白組中篩選可能的PACS-1結(jié)合蛋白。結(jié)果表明，SWISS-PROT蛋白數(shù) 據(jù)庫(kù)中的HSV-1 17株所有71種蛋白質(zhì)中可能與PACS-1結(jié)合的蛋白質(zhì)共有 33種，包括一些囊膜蛋白和被膜蛋白。 為了通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證篩選出來(lái)的33種蛋白質(zhì)中，哪些可以與PACS-1 結(jié)合；除HSV-1糖蛋白E外，哪些可以定位于TGN，我們?cè)?3種蛋白質(zhì) 中，選擇HSV-1的糖蛋白B作為研究對(duì)象，探討其在細(xì)胞中的定位，及其 與PACS-1的作用。首先通過(guò)RT-PCR，從感染HSV的BHK-21細(xì)胞的總 RNA中擴(kuò)增出了HSV-1 SM44株糖蛋白B的胞漿區(qū)，將其克隆入pUC18 第M丫l＼上學(xué)博上淪文 摘要 進(jìn)行測(cè)序。序列分析的結(jié)果表明，HSVI糖蛋白B胞漿區(qū)氨基酸序列在各 病毒株間高llfa保十，胞漿區(qū)含有1個(gè)核定位信號(hào)、2個(gè)以酪鼠酸為基礎(chǔ)的基 序、l個(gè)含何CKll磷酸化位點(diǎn)的酸性氨基酸簇。其次，通過(guò)RTPCR，從 SD人鼠的腦組纖總 RNA中書(shū)增出J－隊(duì)CS刁的功能區(qū)，將其克隆入pUC18 進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明其核符酸序列與文獻(xiàn)報(bào)道的序列完全相同。然后利用 GST表達(dá)系統(tǒng)，在人腸桿菌 BLZI株中表達(dá)了 GST和 HSV糖蛋白胞漿【 的融合蛋臼一GSTMSVlg8Cd及GST和 PACS＊功能區(qū)的融合蛋白 GST／PACS．lfdu首先采用上交實(shí)驗(yàn)設(shè)汁優(yōu)化廠(chǎng)蛋白表達(dá)的條件，然后在優(yōu) 化的表達(dá)條件廠(chǎng)，人規(guī)模的制備廠(chǎng) GST／HSVlgBCd和 GST／PACS刁。 GST川 1：ff以包涵體的形K存在，包淵體經(jīng)溶解Xllffi拆疊門(mén)，蛋 白質(zhì)濃度為 0．165mg／ml，t＄層掃描結(jié)果顯不，融和蛋向的純度為 32．188％。 制苗的 ＊Sw”叭＊S．1鬧 經(jīng)純化和凝！血酶切割后，蛋I”I質(zhì)濃度為 02刀37mg／ml，薄層掃描結(jié)果顯示，凝血酶酶切產(chǎn)牛的 PACS＊ 蛋 I勺的純 l塵為 475889／O；；以 GST／HSVlgBCd為抗你，勸1備］”鼠抗 GST／HSVlgBCd 血消，效價(jià) 31：400。以 PACS．lfd為抗原，制備廠(chǎng)兔抗 PACS．lfd血清， 效價(jià)3！：320（）；；貝疫熒光刊 Western blot的結(jié)漢表叨，兩種免疫血清只有 較產(chǎn)的特仟性，汁能夠識(shí)別人然和變性構(gòu)象的HSVI爐和隊(duì)C｝1。以卜 述內(nèi)種見(jiàn)疫血淌作為抗體，泅過(guò)W標(biāo)i己免疫熒光，將 HSV！gB和 PACS叫 穴I葉定位十感染廠(chǎng)HSVI SM44株的BHK－ZI細(xì)胞的TGN川兔抗PACS－lfd 血柞可以從感染細(xì)胞中共見(jiàn)疫沉淀HSVlgB和P八C�。�。＊ST俘獲法顯不 HSVlgBCd和 PACS1fd可以在體外結(jié)介，門(mén)這種結(jié)合依賴(lài)于CKI！催化的 HSVlgBcd的酸性籠基酸簇中的酪蛋H激酶11（CKll）磷酸化位點(diǎn)的磷酸 化。 以卜紀(jì)果表明，HSV屯B在感染 HSV！的細(xì)胞中定位于 TGN，這種定 位足巾十其胞漿區(qū)酸性氨基酸簇‘j PACS－l的結(jié)合。這捉示，HSV在其發(fā) 生過(guò)程中，胞漿中的核衣殼在TGN處通過(guò)出芽的方式獲得其囊膜。PACSJ 通過(guò)將某些囊膜糖蛋白（可能還有一些被膜蛋白）定位于TGN 而可能在 HSV的發(fā)中過(guò)程中起著重要作用。我們的研究結(jié)果不僅有利于深入了解 HSV的發(fā)牛機(jī)制和 HSV與細(xì)胞的相互作用，而旦為設(shè)計(jì)針對(duì)病毒蛋白與 PACS－l結(jié)合的特
【學(xué)位單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2001
【中圖分類(lèi)】：R373.1
【文章目錄】：
縮略語(yǔ)表
中文摘要
前言
研究?jī)?nèi)容
    第一部分 通過(guò)序列分析篩選單純皰疹病毒Ⅰ型蛋白組中的PACS-1結(jié)合蛋白
    第二部分 單純皰疹病毒Ⅰ型糖蛋白B胞漿區(qū)和PACS-1功能區(qū)的克隆、原核表達(dá)和免疫血清的制備
        一 單純皰疹病毒Ⅰ型SM44株糖蛋白B胞漿區(qū)的克隆、測(cè)序和序列分析
        二 PACS-1的克隆和測(cè)序
        三 單純皰疹病毒Ⅰ型糖蛋白B胞漿區(qū)和PACS-1功能區(qū)原核表達(dá)條件的優(yōu)化及重組蛋白的大量制備
        四 抗單純皰疹病毒Ⅰ型糖蛋白B胞漿區(qū)和PACS-1功能區(qū)免疫血清的制備及其初步鑒定
        討論
    第三部分 PACS-1在單純皰疹病毒Ⅰ型糖蛋白B細(xì)胞內(nèi)定位中的作用
        一 PACS-1 與單純皰疹病毒Ⅰ型糖蛋白B在感染單純皰疹病毒Ⅰ型細(xì)胞中的共同定位
        二 感染單純皰疹病毒Ⅰ型細(xì)胞PACS-1和單純皰疹病毒Ⅰ型糖蛋白B的共免疫沉淀
        三 PACS-1功能區(qū)與單純皰疹病毒糖蛋白B胞漿區(qū)的體外結(jié)合
        討論
小結(jié)
參考文獻(xiàn)
文獻(xiàn)回顧
致謝
附錄： 研究生期間發(fā)表論文情況

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本文編號(hào)：2891920