發(fā)布時(shí)間：2020-11-20 14:12

　　 目的：堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor, bFGF） 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中起到促進(jìn)增生、分化的重要作用，可促進(jìn)各類神經(jīng)移植物的存活和/或功能發(fā)揮。此外，bFGF還保護(hù)神經(jīng)元免受各種損傷因素及興奮性氨基酸的損傷。已有大量文獻(xiàn)報(bào)道了應(yīng)用外源性bFGF可以減少缺血缺氧造成的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦梗死面積或促進(jìn)梗死損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)。上述實(shí)驗(yàn)均從梗死面積的測(cè)定以及動(dòng)物整體行為功能測(cè)定方面描述了外源性bFGF的重要作用。bFGF作為腦內(nèi)含量最高的一類生長因子其含量可以達(dá)到40~50(g/Kg。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中多種細(xì)胞可以表達(dá)bFGF，但其主要來源于星形膠質(zhì)細(xì)胞（Astrocytes, As）。在腦組織受到各種損傷的情況下As可以活化分泌bFGF增加。缺血性損傷后內(nèi)源性bFGF的表達(dá)有無變化？為什么缺血損傷后內(nèi)源性的bFGF不能有效發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用？外源性bFGF進(jìn)入腦內(nèi)對(duì)內(nèi)源性bFGF表達(dá)有無影響？均尚未有實(shí)驗(yàn)探究。我們?cè)噲D在明確缺血損傷后內(nèi)源性bFGF在腦內(nèi)各種細(xì)胞中的動(dòng)態(tài)表達(dá)及其與自身受體表達(dá)的相互關(guān)系的基礎(chǔ)上，為闡明外源性bFGF應(yīng)用缺血性損傷治療的原因及機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 Egr-1(egrly growth response protein 1)能夠與bFGF基因啟動(dòng)子結(jié)合促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄活性。NAB2(NGFI-A binding protein 2)蛋白被認(rèn)為是Egr-1的特異性抑制因子。腦缺血缺氧損傷后是否有Egr-1蛋白及NAB2參與bFGF的表達(dá)未見報(bào)導(dǎo)。bFGF作為硫酸肝素類結(jié)合分子，有雙重受體系統(tǒng)：細(xì)胞外基質(zhì)中硫酸肝素蛋白多糖的低親和力受體及多種細(xì)胞膜表面上的高親和力受體。bFGF與高親和受體結(jié)合后啟動(dòng)了多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，其中MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路最值得關(guān)注， bFGF的表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Egr-1也受到MAPK信號(hào)通路的調(diào)控。外源性bFGF作用于缺血損傷細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制及對(duì)自身表達(dá)的影響尚未見研究報(bào)告。 缺血損傷后血腦屏障受損乃至通透性改變的報(bào)道各家不一，對(duì)bFGF的通透性更無專門的報(bào)告。因而早期應(yīng)用外源性bFGF治療缺血性損傷就具有了一定的盲目性。 本課題試圖通過闡明缺血損傷對(duì)內(nèi)源性bFGF及受體表達(dá)的影響；外源性bFGF對(duì)缺血缺氧細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制及對(duì)內(nèi)源性bFGF表達(dá)的影響以及腦缺血損傷后外源性bFGF用藥窗口等問題為bFGF應(yīng)用臨床治療腦缺血提供實(shí)驗(yàn)與理論依據(jù)。 WP=6 方法：采用大鼠持續(xù)性大腦中動(dòng)脈栓塞模型（permantent middle cerebral artery occlusion, pMCAO），應(yīng)用免疫組化，western-blot, RT-PCR等方法系統(tǒng)觀察了大鼠腦持續(xù)性局灶性缺血損傷后自0.5h起到14d神經(jīng)元和As等細(xì)胞表達(dá)Egr-1、bFGF蛋白及bFGF特異性的高親和力受體bFGFR的動(dòng)態(tài)變化。 用體外原代培養(yǎng)的As的缺血缺氧模型，采用western-blot、免疫熒光雙標(biāo)記的方法觀察了Egr-1、NAB2蛋白表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化并采用凝膠電泳遷移率變動(dòng)分析（EMSA）分析了Egr-1與bFGF啟動(dòng)子結(jié)合能力的動(dòng)態(tài)變化。 在體外原代培養(yǎng)的As的缺氧－給氧損傷后，采用western-blot檢測(cè)了體外缺氧－給氧損傷后外源性bFGF對(duì)MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中raf-MEK-ERK中MEK-1、ERK-1/2蛋白表達(dá)水平、ERK磷酸化水平及SAPK/JNK 通路中JNK磷酸化程度影響。并采用EMSA分別檢測(cè)分析了缺氧－給氧損傷、缺氧－給氧損傷并給予bFGF對(duì)Egr-1蛋白活性的影響，以明確在缺氧損傷后外源性bFGF對(duì)內(nèi)源性bFGF表達(dá)的影響，并在給予bFGF后加入MEK的特異性抑制劑U0126 后檢測(cè)Egr-1的活性，分析了其與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)系。 采用抗BBB抗體免疫組化方法顯示了pMCAO 后不同時(shí)段BBB結(jié)構(gòu)的改變。采用125I標(biāo)記bFGF 的放射標(biāo)記示蹤的方法對(duì)pMCAO后靜脈應(yīng)用bFGF通透血腦屏障的時(shí)間窗口進(jìn)行了探討。 結(jié)果： 體內(nèi) 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在pMCAO損傷后，應(yīng)用半定量RT-PCR顯示在缺血梗死損傷后0.5h bFGFmRNA就開始增加，持續(xù)到損傷后1天（p0.05），免疫組化見缺血 bFGF表達(dá)出現(xiàn)雙相增強(qiáng)，分別是缺血1h及缺血后6h~1d時(shí)缺血邊緣區(qū)bFGF染色增強(qiáng)，主要見于As，表現(xiàn)為胞漿、胞突及細(xì)胞核陽性增強(qiáng)，神經(jīng)元細(xì)胞核反應(yīng)亦增強(qiáng)，但始終弱于As。與免疫組化不同的是western-blot顯示僅在缺血后12h~2d時(shí)分子量為18kDa bFGF含量明顯增加（p0.05）， 22 kDa的bFGF僅在缺氧后1d表達(dá)增強(qiáng)，24 kDa的bFGF僅在缺氧后2d時(shí)表達(dá)增強(qiáng)，未見缺血1h有任何分子量bFGF含量的增加。 半定量RT-PCR顯示bFGFRmRNA在pMCAO后0.5h開始升高(P0.05)，持續(xù)到pMCAO后2h，免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)bFGFR在2～6h明顯增強(qiáng)。bFGFRmRNA 及蛋白表達(dá)均早于bFGFmRNA 和蛋白的表達(dá)高峰。 免疫組化及western-blot顯示缺血后1h~6h時(shí)Egr-1蛋白表達(dá)增加。 在體外原代培養(yǎng)的As缺血缺氧模型上測(cè)得損傷后0.5～4h Egr-1蛋白表達(dá)明顯升高（P0.05），6h迅速回落降低到正常水平。與Egr-1蛋白表達(dá)規(guī)律不同，NAB2在損傷后4h時(shí)表達(dá)開始增強(qiáng)（P0.05），持續(xù)表達(dá)到缺氧1d，表達(dá)時(shí)相晚于Egr-1蛋白的表達(dá)。EMSA顯示缺血缺氧損傷后As中Egr-1核蛋白與bFGF WP=7 啟動(dòng)子結(jié)合活性在4~12h升高。免疫熒光雙標(biāo)記見到在正常情況下Egr-1 蛋白和NAB2蛋白主要存在于As胞漿及核周，胞突明顯著色，細(xì)胞核內(nèi)可見微弱的表達(dá)。缺血1h后，Egr-1 蛋白在細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)開始增強(qiáng)，而NAB2的表達(dá)仍然主要在胞漿內(nèi)。隨著時(shí)間的延長，缺
【學(xué)位單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2003
【中圖分類】：R363
【部分圖文】：

左圖 1 3 泳道 DIG Egr 1 寡聚核苷酸探針對(duì)照反應(yīng) 未標(biāo)記 Egr 針與 As 核蛋白的結(jié)合 DIG-Egr-1 寡聚核苷酸探針與 As 核蛋白的結(jié)合左圖 1~8 泳道分別為對(duì)照組 缺血缺氧損傷后 0.5, 1,2,4,6,12h 和 1d 組 12 EMSA 檢測(cè)持續(xù)性缺血缺氧損傷后 As 中 Egr-1 核蛋白與 bFGF 啟動(dòng)子結(jié)合能 7 EMSA 檢測(cè)持續(xù)性缺血缺血缺氧損傷后 As 中 Egr-1 核蛋白與 bFGF 啟動(dòng)凈灰度組序 分組 凈灰度值1 對(duì)照組 303162 缺血缺氧損傷 0.5h 411043 缺血缺氧損傷 1h 42561.474 缺血缺氧損傷 2h 499885 缺血缺氧損傷 4h 603166 缺血缺氧損傷 6h 611041 21 2

Egr 1 寡聚核苷酸探針對(duì)照反應(yīng) 未標(biāo)記 Egr G-Egr-1 寡聚核苷酸探針與 As 核蛋白的結(jié)合照組 缺血缺氧損傷后 0.5, 1,2,4,6,12h 和 1d 組缺氧損傷后 As 中 Egr-1 核蛋白與 bFGF 啟動(dòng)子結(jié)合能力1 2 結(jié)合帶非 特 異帶特 異 性 條

灰度值與 a-actin 凈灰度值比值組序 分組 M E K - 1 蛋白 E R K - 1 蛋白 E R K - 2 蛋白1 對(duì)照組 1.3506±0.4334 0.3597±0.0103 0.3126±0.06762 缺氧 2h+給氧 10m 1.5967±0.6337 0.1051±0.3165* 0.1002±0.0361*3 缺氧 2h+給氧 20m 0.2178±0.1156* 0.0894±0.0160* 0.1496±0.0297*4 缺氧 2h+給氧 30m 0.1651±0.0829* 0.1088±0.0123* 0.0981±0.0075*5 缺氧 2h+給氧 1h 0.2104±0.1223* 0.1906±0.1629* 0.1968±0.0198*6 缺氧 2h+給氧 2h 0.2706±0.1261* 0.1875±0.0164* 0.1574±0.0099*7 缺氧 2h+給氧 4h 1.3373±0.4206 0.4163±0.0507 0.3490±0.03838 缺氧 2h+給氧 6h 1.3650±0.516 0.4698±0.0647 0.3966±0.00699 缺氧 2h+給氧 12h 0.8081±0.0699 0.5597±0.0965 0.4131±0.062710 缺氧 2h+給氧 1d 1.003±0.1873 0.3446±0.0555 0.3071±0.0427注 注*者表明與對(duì)照組比較具有明顯差異 p<0.05
【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 李宜航;西洋參莖葉皂苷對(duì)大鼠缺血腦組織IL-6和bFGF含量的影響[D];黑龍江中醫(yī)藥大學(xué);2010年

本文編號(hào)：2891535