發(fā)布時(shí)間：2020-11-18 02:30

　　 研究背景:由于地震、車(chē)禍等災(zāi)難的發(fā)生,坐骨神經(jīng)等周?chē)�神�?jīng)的損傷是臨床的常見(jiàn)疾病。目前,自體神經(jīng)移植仍然是修復(fù)周?chē)�神�?jīng)損傷的主要方法,但是自體神經(jīng)移植法具有供體來(lái)源有限、增加供區(qū)創(chuàng)傷以及殘留供區(qū)感覺(jué)功能障礙等缺陷。周?chē)�神�?jīng)再生是現(xiàn)階段神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域的研究重點(diǎn),組織工程領(lǐng)域的一些新發(fā)現(xiàn)為長(zhǎng)節(jié)段缺損性損傷提供了新手段。神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)可分化為各種類(lèi)型的神經(jīng)細(xì)胞,將其移植到損傷處可促進(jìn)軸突再生以及髓鞘形成。課題組此前通過(guò)培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cells,hESCs)發(fā)現(xiàn)胚胎干細(xì)胞可以自發(fā)分化形成神經(jīng)干細(xì)胞。由此我們推測(cè)這種人胚胎干細(xì)胞能夠在特定條件下定向誘導(dǎo)分化成純度較高的神經(jīng)干細(xì)胞(human embryonic stem cell derived-neural stem cells,hESC-NSCs)。由于神經(jīng)干細(xì)胞來(lái)源的局限性,從hESCs分化而來(lái)的NSCs顯得尤為重要。能否高純度、高產(chǎn)量的獲得NSCs是其能否應(yīng)用到臨床細(xì)胞治療的關(guān)鍵問(wèn)題。我們猜測(cè),hESC-NSCs同胎腦來(lái)源的NSCs具有同樣促進(jìn)軸突再生的作用,對(duì)此后續(xù)的研究表明,hESC-NSCs確實(shí)可以通過(guò)間接作用促進(jìn)軸突再生�，F(xiàn)在越來(lái)越多的研究表明NSCs發(fā)揮修復(fù)神經(jīng)損傷的作用不是通過(guò)細(xì)胞直接整合而是通過(guò)分泌因子發(fā)揮作用,并且由于NSCs是有核的活細(xì)胞,具有形成腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)。微囊泡(microvesicles,MVs)是從細(xì)胞條件培養(yǎng)基中分離得到的活性有形成分,是細(xì)胞同周?chē)��?xì)胞或環(huán)境進(jìn)行信息和物質(zhì)傳遞的一種物質(zhì)。并且我們組之前已經(jīng)研究證明過(guò)間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)來(lái)源的微囊泡(MSCs-MVs)可以促進(jìn)坐骨神經(jīng)壓榨性損傷后的再生修復(fù)。因此,我們猜測(cè)人胚胎干細(xì)胞源神經(jīng)干細(xì)胞分泌的微囊泡(microvesicles released from human embryonic stem cell derived-neural stem cells,hESC-NSC-MVs)與MSCs-MVs具有類(lèi)似的促進(jìn)軸突再生的功能,并對(duì)其展開(kāi)進(jìn)一步的研究。研究目的:研究人胚胎干細(xì)胞的神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化及胚胎干細(xì)胞源神經(jīng)干細(xì)胞分泌的微囊泡對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)5mm缺損性損傷的修復(fù)作用。研究方法:(1)將無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)的hESCs定向誘導(dǎo)為神經(jīng)干細(xì)胞,并利用細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫熒光、PCR的方法進(jìn)行鑒定。(2)利用PCR和流式細(xì)胞術(shù)對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)過(guò)貼壁-球轉(zhuǎn)化(AST)后提高干性進(jìn)行說(shuō)明。(3)收集hESC-NSCs的無(wú)血清培養(yǎng)基(條件培養(yǎng)基),運(yùn)用超速離心法提取微囊泡。(4)將hESC-NSC-MVs與背根神經(jīng)節(jié)共培養(yǎng),測(cè)定軸突的長(zhǎng)度。(5)建立SD大鼠坐骨神經(jīng)缺損性損傷模型,應(yīng)用坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(sciatic nerve functional index,SFI)、HE染色、Masson染色等方法評(píng)價(jià)hESC-NSC-MVs對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)損傷修復(fù)作用。研究結(jié)果:(1)hESCs可以分化為神經(jīng)干細(xì)胞,并且神經(jīng)干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志Nestin,Pax6等在P8 NSCs附近表達(dá)最高。(2)神經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)過(guò)AST,神經(jīng)干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志Nestin,Pax6等表達(dá)升高,干性增強(qiáng)。(3)hESC-NSC-MVs與背根神經(jīng)節(jié)共培養(yǎng)的再生軸突長(zhǎng)度優(yōu)于PBS組。(4)成功的構(gòu)建出大鼠坐骨神經(jīng)缺損性損傷模型。神經(jīng)損傷后12周,hESC-NSC-MVs組受損側(cè)后肢形態(tài)學(xué)恢復(fù)和再生軸突的增加都較hESC-NSCs組和PBS組明顯。結(jié)論:(1)hESC可以分化為NSCs,hESC-NSCs表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志。(2)hESC-NSCs可以通過(guò)貼壁-球轉(zhuǎn)化提高神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志的表達(dá)以及增強(qiáng)干性。(3)hESC-NSC-MVs對(duì)坐骨神經(jīng)缺損性損傷具有修復(fù)作用。
【學(xué)位單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：R745
【部分圖文】：

邊緣清晰光滑（圖3.1A）。在神經(jīng)誘導(dǎo)液中培養(yǎng)約 18d 后，細(xì)胞開(kāi)始呈橢圓形、三角形、雙極型或三極型。當(dāng)達(dá)到 75%以上的融合度時(shí)，消化細(xì)胞并重新接種在 Matrigel 培養(yǎng)皿，這些細(xì)胞可以傳代至少 50 代（目前還能繼續(xù)往下傳代），同時(shí)保持其特有的形態(tài)大致不變，并可反復(fù)凍存和復(fù)蘇（圖 3.1B-D）。通過(guò) PCR 和免疫熒光分析，檢測(cè) NSCs 標(biāo)志物的表達(dá)情況。與 hESCs 相比，Pax6、Sox 1 等神經(jīng)干細(xì)胞基因在 hESC-NSCs 中明顯上調(diào)，而多能干性基因 Oct 4 表達(dá)下調(diào)（圖 3.1 E）。圖3.1：hESCs及hESC-NSCsA：生長(zhǎng)在matrigel上的hESCs形態(tài)；B-D：P8

15分析顯示，hESC-NSCs細(xì)胞表面表達(dá)CD 44和CD 133，弱表達(dá)O1，而Neisin、β-IIItubulin和GFAP在hESC-NSCs的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)（圖3.2 C-D）。圖3.2：P8 hESC-NSCs神經(jīng)標(biāo)志物的表達(dá)及細(xì)胞定位A-B：hESC-NSCs的Nestin (A)和Pax6 (B)免疫熒光染色；C-D：P8 hESC-NSCs細(xì)胞膜表達(dá)Nestin, β-III tubulin, GFAP, O1, CD133 and CD44的分析(C)；細(xì)胞內(nèi)表達(dá) Nestin, β-III tubulin,GFAP的分析(D)（A-B：Scale bars 50 μm）。Fig.3.2 Cellular localization of P8 hESC-NSCs markersA-B: hESC-NSCs were immunofluorescence staining for Nestin (A), Pax6 (B). C-D: Cellsmembrance analysis of Nestin

16這些hESC-NSCs可傳代50代，且形狀大致保持不變。我們使用P2、P8和P18hESC-NSCs來(lái)觀(guān)察Nestin、Pax6、Sox1、Sox2的表達(dá)（圖3.3A）。流式細(xì)胞儀分析顯示，Nestin、β-III tubulin、GFAP、O1、CD133在P2、P8和P18 hESC-NSCs中的表達(dá)(圖3.3B)。圖3.3 不同代數(shù)的hESC-NSCs上神經(jīng)標(biāo)志物的表達(dá)A：定量 PCR 分析 Nestin，Pax6，Sox1，Sox2 在 P8 hESC-NSCs，P18 hESC-NSCs 的表達(dá)水平，以 P2 hESC-NSCs 作對(duì)照（n=3，*p<0.05
【參考文獻(xiàn)】

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