發(fā)布時間：2020-11-15 19:25

　　 惡性膠質(zhì)瘤是成人腦部腫瘤中最常見的類型,約占顱腦腫瘤的40-50%,因?yàn)槠浣�潤性而難以通過傳統(tǒng)的手術(shù)切除,并以其極低的生存率為特征。而人類巨細(xì)胞病毒(HCMV)目前在膠質(zhì)瘤中所發(fā)揮的作用引起了相當(dāng)大的興趣和爭議。程序性死亡因子1(PD-1)的單克隆抗體在膠質(zhì)瘤的治療過程中取得了一定的進(jìn)展,但治療結(jié)果仍不盡如人意,其程序性死亡因子配體1(PD-L1,CD274),被認(rèn)為和惡性膠質(zhì)瘤的免疫逃逸機(jī)制有關(guān),并與HCMV的感染具有相關(guān)性,而Toll樣受體3(TLR3)在病原體感染的細(xì)胞或動物中可以誘導(dǎo)抗病毒的狀態(tài),通過對TLR3和膠質(zhì)瘤中PD-L1表達(dá)變化關(guān)系的研究,我們希望探究新的聯(lián)合免疫治療方法,為臨床治療提供新的思路。目的:研究在HCMV感染的膠質(zhì)瘤中,PD-L1的表達(dá)機(jī)制是否與TLR3相關(guān)。方法:使用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)檢測臨床膠質(zhì)瘤標(biāo)本中IE2、PD-L1和TLR3的表達(dá)情況;HCMV感染膠質(zhì)瘤細(xì)胞后,使用q-PCR技術(shù)和免疫熒光染色技術(shù)檢測PD-L1 RNA和蛋白的表達(dá)情況;細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)封閉TLR3的表達(dá);使用WB技術(shù)檢測封閉TLR3表達(dá)的膠質(zhì)瘤在感染HCMV后PD-L1的表達(dá)情況;使用ELISA技術(shù)檢測封閉TLR3表達(dá)的膠質(zhì)瘤感染HCMV后細(xì)胞因子TGF-β和IL-8的分泌情況。結(jié)果:我們在70%的Ⅲ級和85%的Ⅳ惡性膠質(zhì)瘤標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)IE2陽性,與IE2陰性的標(biāo)本相比較,PD-L1和TLR3的表達(dá)量均呈現(xiàn)增高,P0.05;在HCMV感染膠質(zhì)瘤后0、6和72h提取RNA,0、24和72h提取蛋白質(zhì),檢測PD-L1的RNA和蛋白表達(dá)量升高20倍以上;轉(zhuǎn)染siRNA后,TLR3的表達(dá)量通過WB檢測下降70%以上,認(rèn)為封閉成功;封閉TLR3后,感染HCMV后,PD-L1的表達(dá)量相較于未封閉組下降明顯,具有統(tǒng)計學(xué)意義,P0.05;封閉TLR3后,會誘導(dǎo)T細(xì)胞TGF-β的分泌,上升2倍以上,但抑制IL-8的分泌,幾乎無法檢測。結(jié)論:HCMV感染的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)量相較于未感染組更高,這可能是HCMV促進(jìn)膠質(zhì)瘤惡性程度升高的原因之一。而在封閉TLR3的表達(dá)后,在HCMV感染的腫瘤細(xì)胞中可以觀察到PD-L1的表達(dá)下降,我們認(rèn)為PD-L1的表達(dá)可以由膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的TLR3觸發(fā)介導(dǎo),因此,我們提出了使用組合PD-L1單克隆抗體與阻斷TLR3觸發(fā)來針對HCMV感染的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的新型免疫治療。
【學(xué)位單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R739.4
【文章目錄】：
摘要
abstract
引言
實(shí)驗(yàn)材料和試劑
    1.病理樣本和細(xì)胞病毒
    2.主要實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備
    3.主要實(shí)驗(yàn)試劑來源及配制方法
        3.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑來源
        3.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑配制方法
實(shí)驗(yàn)方法
    1.臨床標(biāo)本組織化學(xué)染色
    2.膠質(zhì)瘤細(xì)胞感染HCMV
        2.1 細(xì)胞復(fù)蘇
        2.2 細(xì)胞的傳代
        2.3 細(xì)胞的凍存
        2.4 HCMV AD169 毒株的制備
        2.5 HCMV病毒的滴度的測定
        2.6 HCMV感染U87、原代膠質(zhì)瘤和星形膠質(zhì)細(xì)胞后RNA提取
        2.7 RNA反轉(zhuǎn)錄為DNA
        2.8 熒光實(shí)時定量PCR分析HCMV感染神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞后PD-L1 的表達(dá)
    3.免疫熒光技術(shù)檢測細(xì)胞感染HCMV后 PD-L1 的表達(dá)變化
        3.1 細(xì)胞感染HCMV處理
    4.siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞封閉TLR3 表達(dá)
        4.1 小干擾RNA的構(gòu)建
        4.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA
    5.HCMV感染TLR3 封閉的膠質(zhì)瘤細(xì)胞后PD-L1 的表達(dá)情況
    6.共培養(yǎng)檢測細(xì)胞因子
    7.統(tǒng)計學(xué)分析
結(jié)果分析
    1.臨床標(biāo)本組化染色分析
    2.細(xì)胞感染HCMV后 PD-L1的mRNA和蛋白表達(dá)變化
    3.封閉TLR3 表達(dá)及封閉后HCMV感染細(xì)胞PD-L1 的表達(dá)變化
    4.封閉TLR3 后誘導(dǎo)TGF-β分泌并抑制IL-8 分泌
討論
參考文獻(xiàn)
綜述
    1.1 人巨細(xì)胞病毒
    1.2 膠質(zhì)瘤與HCMV的關(guān)系
    1.3 PDL1 參與免疫逃逸
    1.4 HCMV感染后Toll樣受體的變化
    1.5 TLR3 觸發(fā)PD-L1 上調(diào)
    1.6 結(jié)論
    綜述參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間研究成果
致謝

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