發(fā)布時間：2020-06-13 04:39

【摘要】：腦膠質瘤是最常見的惡性原發(fā)性神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤,占惡性腦腫瘤的81%,是一種破壞性極強的顱內腫瘤,并以其高度侵襲性而聞名。世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)依據(jù)其惡性程度,將神經(jīng)膠質瘤分為I-IV級。多形性膠質母細胞瘤(Glioblastoma multiforme,GBM)是WHO IV級膠質瘤之一,其以腫瘤細胞的快速生長為特征,是最常見和最致命的成人腦腫瘤。膠質母細胞瘤常常位于腦皮層下部,呈浸潤性生長,并且侵入數(shù)個腦葉和深部大腦結構,與周圍正常腦組織無明顯界限。因此,在臨床實踐中,顯微手術難以完整分離和切除腫瘤組織,導致患者出現(xiàn)腫瘤復發(fā)且預后極差。迄今為止,化學治療已成為旨在解除腫瘤占位效應的手術后的主要治療方式。然而,GBM經(jīng)常出現(xiàn)出化療耐藥性,使得患者在治療后的存活率和生存期皆不理想。腫瘤是一系列的全身反應癥狀的系統(tǒng)性疾病,其主要特征是腫瘤細胞極快的生長速度和無限增殖的能力。微管在細胞生長周期中扮有重要角色,是治療腫瘤的重要靶點。由α-、β-tubulin蛋白異二聚體聚合而成的微管,是組成細胞骨架的基本元件。它在細胞增殖,細胞形態(tài)維持,細胞內物質轉運等細胞功能中扮有重要角色。在細胞增殖的DNA合成后期(G2期),由微管作為主要構成成分的中心體于細胞兩級形成紡錘體,調節(jié)細胞有絲分裂,對維持染色體的穩(wěn)定起著重要的作用。當微管結構遭到破壞,紡錘體形成異常致使細胞正常生理功能紊亂,細胞分裂阻滯于G2期,無法正常進入下一細胞周期,導致細胞死亡。α-tubulin作為組成微管結構的異構體之一,在人體內存在有多種亞型。研究發(fā)現(xiàn),人體組織中至少有15種基因亞型編譯α-tubulin蛋白,最常見的有TUBA1A、TUBA1B、TUBA1C、TUBA3D、TUBA3E、TUBA4A、TUBA8等。不同的基因亞型在不同的組織中含量不同,也參與不同的細胞功能。值得關注的是,在最近的一項研究中發(fā)現(xiàn),TUBA1B的表達量與肺癌患者的臨床預后密切相關,說明TUBA1B是肺癌的癌基因。目前,未見TUBA1B在膠質瘤患者中臨床信息分析的報道。流行病學研究發(fā)現(xiàn),來自十字花科類植物的蘿卜硫素(sulforaphane,SFN)及其衍生物,在預防癌癥和抗腫瘤中發(fā)揮重要作用。它是迄今為止人類在自然植物中發(fā)現(xiàn)的抗癌能力最強的化合物。多項研究證實,在包括肺癌,膀胱癌,皮膚癌,腎癌等多種腫瘤細胞中,SFN可以通過多種信號轉導途徑,抑制腫瘤細胞生長,促進腫瘤細胞死亡。SFN經(jīng)人體代謝可生成半胱氨酸蘿卜硫素(Sulforaphane-cysteine,SFN-Cys)和N-乙酰半胱胺酸蘿卜硫素(Sulforaphane-N-acetyl-L-cysteine SFN-NAC)等代謝物。在各組織中,SFN以其代謝物為主要存在形式。這些代謝物在人體內具有更高的血漿濃度和更長的藥物半衰期。意味著它們可能具有更好的抗腫瘤效果。本研究使用SFN-NAC處理GBM細胞,發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞形態(tài)和增殖活性均受到抑制。在免疫印跡實驗(Western blot)中,SFN-NAC下調腫瘤細胞α-tubulin表達。在激光掃描共聚焦顯微鏡實驗中,可看到SFN-NAC促使腫瘤細胞微管結構紊亂。這些結果表明:SFN-NAC破壞微管,抑制GBM細胞生長。自噬是所有的真核細胞中高度保守的自我維護機制,它通過降解清除細胞內破壞的細胞器,錯誤折疊的蛋白,長壽蛋白,細胞代謝產(chǎn)生的堆積物等物質,并再次循環(huán)利用,以達到細胞自身的健康狀態(tài)。自噬可分為大自噬(本文如無特別說明皆指大自噬),小自噬,分子伴侶介導的自噬三種模式。微管相關蛋白1輕鏈3蛋白(LC3)是細胞自噬水平的重要標志。LC3偶聯(lián)到自噬體上以及胞漿內LC3II/LC3I的比率,已被用來作為自噬水平評價和測定的公認指標。目前發(fā)現(xiàn)細胞內調控自噬的通路有多種途徑,細胞外調節(jié)蛋白激酶(ERK1/2)作為重要的細胞信號轉導分子,可以通過調節(jié)自噬的相關蛋白而調控細胞自噬水平。本研究發(fā)現(xiàn),在SFN-NAC處理后,GBM細胞中無論ERK1/2磷酸化水平、LC3II/LC3I的比率還是α-tubulin的下調均遵循藥物計量反應關系,同時使用ERK1/2通路抑制劑(PD98059)后,SFN-NAC引起的GBM細胞中LC3II/LC3I的比率上調和α-tubulin的下調均得到逆轉,接著在GBM細胞轉染LC3 siRNA后,SFN-NAC引起的α-tubulin的下調也得到了逆轉。為了進一步研究α-tubulin和LC3的關系,本研究使用激光掃描共聚焦顯微鏡技術和蛋白質免疫共沉淀(Co-IP)技術,發(fā)現(xiàn)SFN-NAC增強了細胞中LC3和α-tubulin的直接結合能力。透射電子顯微鏡技術也觀察到了SFN-NAC處理后的GBM細胞中,出現(xiàn)了標志自噬的超微結構。這些結果表明,在GBM細胞被SFN-NAC處理后,細胞通過激活ERK1/2通路調控細胞自噬水平,進而調控細胞中α-tubulin的表達。自噬在腫瘤治療過程中扮演著重要角色。不同的細胞和不同的細胞時期中,自噬扮演的功能各不相同。研究發(fā)現(xiàn),一定程度的自噬可以促進腫瘤細胞的發(fā)展和轉移。而過度的細胞自噬可以導致腫瘤細胞死亡,這也稱之為II型細胞程序性死亡。為了進一步研究SFN-NAC引起的自噬與腫瘤細胞侵潤和凋亡的關系。本研究使用侵襲實驗(Transwell)檢測了SFN-NAC抑制腫瘤侵襲的能力,并用自噬選擇性抑制劑3-MA抑制細胞自噬,發(fā)現(xiàn)聯(lián)合使用SFN-NAC和3-MA后,GBM細胞的侵潤能力較單獨使用SFN-NAC下降更加明顯。隨后,利用Western blot檢測了細胞侵潤相關蛋白S100A4的表達,證實SFN-NAC引起的細胞自噬促進了S100A4的表達。同樣,SFN-NAC誘導的細胞的凋亡水平也在使用3-MA抑制自噬后較單獨使用SFN-NAC明顯上升。這些結果表明,在GBM細胞中,SFN-NAC引起的細胞自噬促進了細胞侵潤,拮抗細胞凋亡。最后,利用中國腦膠質瘤基因組(CGGA)數(shù)據(jù)庫和美國癌癥和腫瘤基因圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫,分析預測了TUBA1B在膠質瘤患者中與腫瘤級別和臨床預后的關系,并發(fā)現(xiàn)TUBA1B基因作為膠質瘤患者的獨立預后因素而存在。這些結果驗證了TUBA1B是膠質瘤患者的癌基因之一。綜上所述,本研究通過膠質瘤患者數(shù)據(jù)庫篩選出膠質瘤癌基因TUBA1B,并且闡明了SFN-NAC下調GBM細胞α-tubulin蛋白的具體機制和自噬在細胞侵潤和凋亡中的作用。這作為SFN-NAC藥物抗GBM腫瘤的相關機制研究,為指導SFN-NAC日后的臨床應用提供理論支持。第一部分N-乙酰半胱氨酸蘿卜硫素通過自噬調節(jié)膠質母細胞瘤U87MG和U373MG細胞中α-tubulin表達水平目的:膠質母細胞瘤是神經(jīng)系統(tǒng)中最常見的極差預后的原發(fā)性腦腫瘤,標準的臨床治療方案包括手術切除、化學聯(lián)合放射療法。在手術切除腫瘤后,化學藥物治療是最主要的方法,作為目前膠質瘤化療唯一常用的化療藥物替莫唑胺(temozolomide,TMZ),因腫瘤經(jīng)常出現(xiàn)對其耐藥性,導致膠質瘤患者的生存期極短。因此,急需尋找一種新的高效低毒的化療替代藥物。流行病學調查發(fā)現(xiàn),日常十字花科類植物的食入,可有效降低癌癥的發(fā)病率,進一步研究發(fā)現(xiàn)其天然提取成分SFN是目前人類在自然界中發(fā)現(xiàn)的有效抗癌物。結果表明SFN通過破壞微管抑制膠質母細胞瘤細胞生長,N-乙酰半胱氨酸蘿卜硫素是SFN衍生物,也是SFN在人體內的代謝產(chǎn)物,具有更長的半衰期和更好通過血腦屏障(BBB)的能力,可能會更有效的抑制腫瘤生長。本實驗將研究SFN-NAC抑制膠質母細胞瘤U87MG和U377MG細胞生長的機制和自噬在其中的扮演的作用角色。為日后的臨床應用提供基礎理論支持。方法:利用細胞增殖活性實驗(MTT)檢測SFN-NAC抑制膠質母細胞瘤細胞能力;利用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)學變化;利用免疫印跡實驗(Western blot)檢測細胞內蛋白α-tubulin、LC3II/LCI比率和ERK磷酸化水平;利用免疫共沉淀實驗(Co-IP)及免疫熒光細胞化學實驗(Confocal)檢測LC3與α-tubulin結合能力;利用siRNA沉默技術敲低LC3表達。利用透射電子顯微鏡技術(TEM)觀察細胞內自噬體,自噬溶酶體等細胞超微結構。結果:SFN-NAC抑制膠質母細胞瘤U87MG和U373MG細胞增殖活性遵循劑量依賴關系;SFN-NAC改變U87MG和U373MG細胞形態(tài)遵循劑量依賴關系;SFN-NAC處理濃度為30μmol/L時,U87MG和U373MG細胞無論形態(tài)還是細胞活力,皆出現(xiàn)明顯改變,因此本研究選取30μmol/L為后續(xù)實驗研究濃度;Western blot顯示SFN-NAC下調α-tubulin,上調LC3II/LCI比率同時激活ERK磷酸化水平遵循劑量依賴關系;利用ERK通路抑制劑(PD98059)后,這些結果被逆轉;利用LC3 siRNA轉染腫瘤細胞后,SFN-NAC引起的腫瘤細胞α-tubulin下調被逆轉;Co-IP及Confocal結果顯示SFN-NAC增強LC3II與α-tubulin的結合能力。電鏡結果顯示,SFN-NAC增加細胞內自噬體,自噬溶酶體的形成。第二部分N-乙酰半胱氨酸蘿卜硫素誘導的細胞自噬調節(jié)膠質母細胞瘤U87MG和U373MG細胞侵潤和凋亡目的:膠質母細胞瘤作為惡性程度最高的腦腫瘤,具有極強的侵襲能力和極高的生長速率�？刂萍毎�侵襲和誘導細胞凋亡是治療腫瘤的重要策略。自噬作為細胞本身高度保守的自我降解代謝機制,在腫瘤的治療中扮有重要角色。研究顯示:在腫瘤治療過程中,自噬可促進腫瘤耐藥性增加,拮抗凋亡,促進腫瘤細胞存活;自噬也可通過調控細胞上皮-間充質轉化促進侵潤;另一方面,過度的自噬可導致細胞自噬性程序死亡,也稱Ⅱ型程序性死亡。前期結果顯示,SFN及其部分衍生物可抑制膠質母細胞瘤侵潤,促進細胞凋亡。本實驗將研究自噬在SFN-NAC抑制膠質母細胞瘤U87MG和U373MG細胞中與腫瘤侵潤和凋亡的關系,為在臨床上應用SFN-NAC治療膠質母細胞瘤患者提供理論支持。方法:利用侵襲實驗(Transwell)檢測SFN-NAC抑制膠質瘤細胞侵襲能力;利用流式細胞術檢測SFN-NAC誘導凋亡能力。利用免疫印跡實驗(Western blot)檢測細胞內蛋白S100A4表達;利用siRNA沉默技術敲低LC3表達。利用自噬選擇性抑制劑3-MA抑制腫瘤細胞自噬。利用透射電子顯微鏡技術(TEM)觀察細胞超微結構。結果:侵襲實驗結果顯示:SFN-NAC(15μmol/L)抑制了U87MG和U373MG細胞侵潤能力,3-MA(2.5mmol/L)不改變腫瘤細胞侵潤能力。聯(lián)合使用SFN-NAC和3-MA后腫瘤細胞侵潤能力較單用SFN-NAC下降。通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn):SFN-NAC實驗濃度為30μmol/L時,SFN-NAC誘導腫瘤細胞LC3II/LC3I比率上升、上調S100A4表達,利用LC3 siRNA轉染腫瘤細胞后,SFN-NAC引起的腫瘤細胞S100A4表達上調被逆轉。凋亡實驗結果顯示:SFN-NAC誘導膠質母細胞瘤凋亡并遵循劑量依賴關系。透射電鏡下可見細胞出現(xiàn)核固縮,核碎裂等凋亡特征現(xiàn)象。在SFN-NAC聯(lián)合加入3-MA處理腫瘤細胞后,細胞凋亡水平較單用SFN-NAC增強。第三部分利用高通量數(shù)據(jù)分析TUBA1B在膠質瘤患者中的臨床意義目的:α-tubulin蛋白在人體內有15種亞型,并被不同的mRNA編碼,它們分別是TUBA1A,TUBA1B,TUBA1C,TUBA3D,TUBA3E,TUBA4A,TUBA8等。TUBA1B作為其中之一,高表達于人膠質瘤細胞中。同時,在其它癌癥里,發(fā)現(xiàn)其與腫瘤分級,預后等臨床信息高度相關。為了闡明TUBA1B在膠質瘤中表達與臨床意義,本研究利用臨床數(shù)據(jù)進行分析,并對其功能進行預測。方法:分別使用T檢驗,Kaplan-Meier生存分析和Cox生存分析等數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法評估TUBA1B基因與膠質瘤患者相關臨床信息關系。利用GO分析預測TUBA1B基因的功能,對于所有統(tǒng)計學方法,P0.05被認為是有統(tǒng)計學意義。結果:TUBA1B表達量隨著膠質瘤級別的增高而增高。生存分析中:高表達TUBA1B的患者的生存周期低于低表達TUBA1B的患者。TUBA1B與患病時的患者年齡,腫瘤分級及IDH突變類型共為患者預后的獨立危險因素。TUBA1B與細胞周期關系密切。結論1.SFN-NAC作為天然食物來源的抗腫瘤細胞的小分子物質,具有低毒高效的特點,能夠破壞膠質母細胞瘤細胞微管結構從而抑制腫瘤細胞生長。2.SFN-NAC在膠質母細胞瘤細胞中,通過活化ERK1/2,調控細胞自噬,進而下調α-tubulin表達。是SFN-NAC靶向膠質瘤癌基因TUBA1B編譯的蛋白α-tubulin治療膠質瘤的重要機制。3.SFN-NAC引起的細胞自噬促進細胞侵潤,拮抗細胞凋亡。
【圖文】：

41圖 2 SFN-NAC 改變 U87MG 和 U373MG 細胞形態(tài)Fig.2 SFN-NAC induced GBM cell morphological alteration.The (A) U87MG and (B) U373MG cells were examined with Leica DMIRB Microscope at × 200 magnification. Cellstreated with various concentrations of SFN-NAC (0, 10, 20, 30, 40 and 50 μM) generated morphological changes.

圖3 SFN-NAC誘導膠質母細胞瘤細胞自噬Fig.3 SFN-NAC induced autophagy in GBM cellsAutophagosomes and autophogelysomes were observed via transmissionelectron microscopy. Arrows indicate autophagosomes or autolysosomes, solidarrow indicates autophagosome and dotted arrow indicates autolysosome.Scale bar: (A-B, D-E: 1μm), (C, F: 0.5μm).
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R739.41;R730.2

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本文編號：2710662