發(fā)布時間：2020-11-11 21:30

　　 目的:構(gòu)建含有梅毒螺旋體(Treponema pallidum, Tp)外膜蛋白Tp 0319的優(yōu)勢表位區(qū)的原核表達載體pQE32/ Tp0319,并在E.coli M15中誘導(dǎo)表達目的蛋白,純化表達產(chǎn)物并對其進行免疫原性和免疫反應(yīng)性分析,為探索Tp 0319重組蛋白在臨床梅毒血清學(xué)診斷中的應(yīng)用價值和其免疫活性提供實驗依據(jù)。 方法:通過生物信息學(xué)分析,挑選Tp0319基因優(yōu)勢抗原表位,以Tp Nichols株基因組DNA為模板,高保真聚合酶鏈反應(yīng)擴增目的片段,將其克隆至原核表達載體pQE32中構(gòu)建重組質(zhì)粒pQE32/ Tp0319,然后將其轉(zhuǎn)化至表達宿主菌E.coli M15中進行誘導(dǎo)表達,利用SDS-PAGE和Western blot進行分析和鑒定表達產(chǎn)物;Ni-NTA親和層析柱純化重組蛋白,并進行稀釋透析復(fù)性, BCA法測定純化蛋白濃度。用純化、復(fù)性的Tp0319重組蛋白包被微孔板,建立間接ELISA方法,檢測梅毒參比血清和臨床梅毒患者血清,同時與TPPA法進行比較,根據(jù)重組蛋白與梅毒陰陽性血清的反應(yīng)情況,評價重組抗原在梅毒血清學(xué)診斷中的應(yīng)用價值。同時用純化的Tp0319重組蛋白免疫新西蘭兔,間接ELISA方法檢測免疫兔血清中Tp0319多克隆抗體的效價,對Tp0319重組蛋白的免疫原性進行分析。 結(jié)果:軟件分析Tp0319基因的抗原表位選擇了Tp0319基因的116-939bp位堿基序列為目的表位(片段長度為824bp,編碼274個氨基酸);PCR擴增得到大小約為824bp的目的片段;構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定和測序鑒定證明其中插入片段為Tp0319目的基因,測序結(jié)果與Genbank上登錄序列完全一致;SDS-PAGE分析顯示,在IPTG誘導(dǎo)下,重組工程菌表達了一相對分子量(Mr)約為30kDa的目的蛋白條帶,目的蛋白在菌體細胞內(nèi)主要以包涵體形式存在;經(jīng)Ni-NTA親和純化獲得了純度在95%以上的重組蛋白;Western blot檢測其能與梅毒陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng);以重組蛋白為包被抗原建立間接ELISA法,檢測梅毒參考血清,其陰陽性符合率均為100%;對TPPA法檢測的150份陰陽性血清進行檢測,與TPPA法比較ELISA法的靈敏度為90.7%,特異度為100%,ELISA法與TPPA法符合率為95.3%;利用純化復(fù)性的Tp0319重組蛋白免疫新西蘭兔,間接ELISA法測定兔免疫血清特異性抗體效價在1:10 240以上。 結(jié)論: 1、成功構(gòu)建了pQE32/ Tp0319原核表達體,將其轉(zhuǎn)化至E.coli M15后表達出了一相對分子量(Mr)約30kDa的重組蛋白; 2、Tp0319重組蛋白具有良好的免疫原性,能刺激新西蘭兔產(chǎn)生高效價的特異性抗體; 3、Tp0319重組蛋白具有較好的免疫反應(yīng)性,能與梅毒陽性血清特異性結(jié)合,有望應(yīng)用于梅毒血清學(xué)診斷。
【學(xué)位單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2008
【中圖分類】：R759.1
【部分圖文】：

gcca ataccttttc agatccccaa aaggggcagg cgctcgcgggcg tgaatgtcat ttttcaagta gcggggggca caggaaagcgcg atcgtcgtct caatggtcag gacgtgtggg ttattggcatgg atggggtgta cgatgggtcg aagtctgtgg tgcttaccggatg tcgctgcgga gcggatctca aagatggcgt acgatggtcca ttatgttcgg gcttgaagac aaggcagtgg ggattcctagca gtgcggttat ggagaaaatt cggagttttg aggagaagagtgg ttccggtgcg atctgcacgc atgatgaact aa因的 PCR 擴增產(chǎn)物于 1.0%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示，在異性條帶（圖 1），與預(yù)期片斷大�。�824bp

圖 2 重組質(zhì)粒 pQE32 /Tp0319 雙酶切電泳圖apping of recombinant plasmid pQE32 /Tp031.ecombinant plasmid pQE32/Tp0319 digested w分析-BLAST 分析行確證，對該重組質(zhì)粒進行序列測定， GenBank 上登陸的目的序列進行比較 GenBank 登錄的序列號為 AE000520 的確。Treponema pallidum subsp. pallidum str. Nich

粒在 E.coli M15 中的誘導(dǎo)表達和鑒定2 /Tp0319重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli M15表達宿主菌中，進行果顯示：誘導(dǎo)菌在 Mr約為 30kDa 處有一明顯條帶，與提高蛋白的表達量和純化需要，本研究從誘導(dǎo)溫度、I面進行表達條件的優(yōu)化。PTG 誘導(dǎo)劑量對 Tp0319 重組蛋白表達的影響2/Tp0319 重組表達體加入不同劑量 IPTG，采用相同的表達，SDS-PAGE 電泳結(jié)果表明，IPTG 的劑量對蛋白的影響，在 IPTG 濃度為 0.5mmol/L 時表達量最高（圖
【參考文獻】

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1 劉絢,石姜,王毅;檢測梅毒的幾種試驗方法的對比評價[J];陜西醫(yī)學(xué)檢驗;2001年02期

本文編號：2879772