發(fā)布時間：2020-11-11 04:10

　　 背景:原發(fā)性皮膚淀粉樣變(Primary cutaneous amyloidosis,PCA)是一種頑固性瘙癢性皮膚病,其典型的組織病理學(xué)改變?yōu)楸砥ぜ��?xì)胞層增厚和角化過度,真皮乳頭層可見大量淀粉樣物質(zhì)沉積。淀粉樣物質(zhì)的形成與角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。大多數(shù)原發(fā)性皮膚淀粉樣變病例為散發(fā),但是南美洲和臺灣曾多次報道過家族聚集現(xiàn)象,即家族性原發(fā)性皮膚淀粉樣變(Familiar primary cutaneous amyloidosis,PCA)。家族性原發(fā)性皮膚淀粉樣變的致病基因被定位于OSMR基因。OSMR基因編碼OSMRβ蛋白,后者為OSM二型受體及IL31受體的組成成分,這兩種受體分別與兩種細(xì)胞因子OSM和IL31結(jié)合,通過JAK-STAT和MAPK通路完成磷酸化和信號傳導(dǎo)。當(dāng)OSMR基因發(fā)生突變時,一方面突變的角質(zhì)形成細(xì)胞更易發(fā)生凋亡,導(dǎo)致角蛋白在真皮淺層沉積;另一方面,OSMRβ/IL31RA信號通路障礙,對抗凋亡的作用減弱,角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡增加,退化的角化性物質(zhì)在真皮淺層沉積,最終導(dǎo)致皮膚淀粉樣變的發(fā)生。沙利度胺對多種頑固性瘙癢性皮膚病有效,可能是通過不同的作用機制。原發(fā)性皮膚淀粉樣變治療抵抗,傳統(tǒng)治療方法如抗組胺藥、糖皮質(zhì)激素及窄波紫外線效果有限。曾有報道應(yīng)用沙利度胺治療輕鏈淀粉樣變。我們前期應(yīng)用沙利度胺成功治療了家族性原發(fā)性皮膚淀粉樣變患者,臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)沙利度胺可明顯緩解皮膚瘙癢,并在治療后的組織切片中發(fā)現(xiàn)淀粉樣物質(zhì)明顯減少。在前期實驗中,我們將OSMR基因敲除細(xì)胞系進(jìn)行全蛋白組學(xué)鑒定,得出多種差異蛋白表達(dá),差異蛋白的功能、KEGG富集結(jié)果。其中,以TC-PTP上調(diào)表達(dá)最為顯著。同時,KEGG通路富集結(jié)果顯示,上調(diào)蛋白在Jak-STAT通路富集現(xiàn)象最為顯著。T細(xì)胞蛋白酪氨酸磷酸酶(TC-PTP;由PTPN_2編碼),是PTP家族中第一個被認(rèn)知的成員,特異性表達(dá)于胚胎和成人組織細(xì)胞中,尤其在造血系統(tǒng)存在高表達(dá)。TC-PTP參與包括細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞凋亡等通過去磷酸化來完成各種生物學(xué)功能的調(diào)節(jié),參與調(diào)節(jié)的目標(biāo)底物包括JAK1、JAK3、Stat1、Stat3、Stat5等,TC-PTP對JAK/Stat通路起到負(fù)向調(diào)節(jié)的作用。學(xué)者通過構(gòu)建PTPN_2基因敲除鼠,提取小鼠皮膚組織上皮細(xì)胞,應(yīng)用Western Blot方法檢測P-AKT和P-Stat3的水平,結(jié)果顯示二者表達(dá)均升高。紫外線照射能夠增加Stat3磷酸化水平,同時能夠使TC-PTP表達(dá)增加。學(xué)者通過構(gòu)建PTPN_2基因敲除及過表達(dá)細(xì)胞系,給予不同時間紫外線照射干預(yù),得出結(jié)論,在紫外線照射下,TC-PTP能夠抑制Stat3介導(dǎo)的小鼠角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖功能,因此,TC-PTP在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡中具有重要的作用。OSMR基因是否能夠通過上調(diào)TC-PTP的表達(dá),對家族性原發(fā)性皮膚淀粉樣變的發(fā)生機制產(chǎn)生影響。沙利度胺是否通過作用于Stat3通路對皮膚淀粉樣變的發(fā)生產(chǎn)生影響,為本實驗關(guān)注的重點。實驗材料和方法:1、實驗對象細(xì)胞系選擇為人角質(zhì)形成細(xì)胞系(HaCaT),購于江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。2、siRNA轉(zhuǎn)染方法敲除目標(biāo)基因OSMR,PTPN_2將細(xì)胞接種于6孔板,每孔50萬個細(xì)胞。Lipofectamine?RNAiMAX被用作轉(zhuǎn)染試劑。Silencer?Select negative control siRNA 1被用作陰性對照。轉(zhuǎn)染后于24、48、72小時提取RNA和蛋白用于驗證敲除效率。使用10 nmol siRNA為最終濃度。3、Icelligence方法篩選沙利度胺作用濃度將細(xì)胞接種于Icelligence細(xì)胞培養(yǎng)板,分別加入沙利度胺濃度為0,10nM,100nM,1000nM,10000nM,通過細(xì)胞增殖曲線,確定藥物對細(xì)胞增殖無影響的最適濃度。4、MTS檢測加入沙利度胺前后siOSMR對細(xì)胞增殖的影響利用MTS方法檢測加入沙利度胺前后OSMR基因敲除對細(xì)胞增殖的作用。將siOSMR細(xì)胞組,加入沙利度胺后siOSMR細(xì)胞組和陰性對照組細(xì)胞接種于96孔板中,分別于第0天、1天、2天、3天和4天進(jìn)行檢測,490nm處觀察吸光度值。5、流式細(xì)胞術(shù)檢測加入沙利度胺前后siOSMR對細(xì)胞凋亡的影響利用流式細(xì)胞術(shù)檢測加入沙利度胺前后siOSMR對細(xì)胞凋亡的影響。將siOSMR細(xì)胞組,加入沙利度胺后si OSMR細(xì)胞組和陰性對照組細(xì)胞接種于六孔板中,用FITC AnnexinⅤ凋亡試劑盒和PI試劑檢測細(xì)胞凋亡的變化。6、利用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)建立OSMR基因敲除穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系細(xì)胞接種于24孔板,將Hacat細(xì)胞MOI值定為100,確定慢病毒轉(zhuǎn)染量。于轉(zhuǎn)染后24、48、72小時于熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率。加入puromycin對轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行篩選。應(yīng)用實時定量PCR檢測,western blot檢測的方法對建立的可穩(wěn)定傳代細(xì)胞進(jìn)行驗證。7、對OSMR基因敲除穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系進(jìn)行人細(xì)胞樣本全蛋白定量蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定將細(xì)胞分為慢病毒對照組和OSMR基因敲除組,進(jìn)行人細(xì)胞樣本全蛋白定量蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定,包括差異蛋白表達(dá)檢測和差異蛋白功能分類、功能富集和聚類分析。8、Western blot方法檢測沙利度胺對Stat1、3、5,Akt通路蛋白表達(dá)的影響采用Western blot方法檢測加入沙利度胺前后Stat1、3、5,Akt通路蛋白表達(dá)水平的變化。按照蛋白提取法提取細(xì)胞中蛋白;BCA檢測蛋白濃度;經(jīng)制膠、跑膠、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗、二抗、ECL顯色并拍照,觀察蛋白表達(dá)變化。9、統(tǒng)計學(xué)分析利用GraphPad Prism 5軟件對資料進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析及圖表的繪制,組間比較用t檢驗及方差分析,p0.05時認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果:1、OSMR基因敲除對角質(zhì)形成細(xì)胞增殖功能的影響應(yīng)用MTS方法,檢測OSMR基因敲除對角質(zhì)形成細(xì)胞增殖功能的影響。結(jié)果顯示,OSMR基因敲除可以顯著抑制細(xì)胞的增殖能力,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。(p0.001)2、OSMR基因敲除對角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡的影響采用流式細(xì)胞術(shù)的方法,檢測OSMR基因敲除對角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示,OSMR基因敲除可以使角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡增加,重復(fù)三次實驗,結(jié)果差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。(p0.05)3、沙利度胺對OSMR基因敲除角質(zhì)形成細(xì)胞增殖功能的影響應(yīng)用MTS方法,檢測沙利度胺對OSMR基因敲除角質(zhì)形成細(xì)胞增殖功能的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),沙利度胺可以增加OSMR基因敲除角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖能力,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。(p0.05)4、沙利度胺對OSMR基因敲除角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡的影響采用流式細(xì)胞術(shù)的方法,檢測沙利度胺對OSMR基因敲除角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),沙利度胺降低OSMR基因敲除角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡,重復(fù)三次實驗,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。(p0.05)5、沙利度胺對OSMR相關(guān)通路蛋白表達(dá)的影響應(yīng)用Western Blot方法,檢測沙利度胺對OSMR相關(guān)通路蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示,OSMR基因敲除角質(zhì)形成細(xì)胞P-Stat3表達(dá)量減少,加入沙利度胺后,P-Stat3表達(dá)量增加。OSMR基因敲除對Stat3的表達(dá)無明顯影響。OSMR基因敲除角質(zhì)形成細(xì)胞Stat1和P-Stat1表達(dá)量均減少,以P-Stat1減少更為明顯。加入沙利度胺后,Stat1和P-Stat1表達(dá)量無明顯增加。OSMR基因敲除對角質(zhì)形成細(xì)胞Stat5和P-Stat5表達(dá)量無明顯影響。OSMR基因敲除對角質(zhì)形成細(xì)胞Akt和P-Akt表達(dá)量無明顯影響。6、人細(xì)胞樣本全蛋白定量蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定結(jié)果將OSMR基因敲除穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系與慢病毒轉(zhuǎn)染對照組進(jìn)行人細(xì)胞樣本全蛋白定量蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定,結(jié)果顯示,OSMR基因敲除可以導(dǎo)致多種差異蛋白表達(dá),其中以上調(diào)TC-PCP表達(dá)最為顯著。KEGG通路富集結(jié)果顯示,上調(diào)蛋白在Jak-STAT通路富集現(xiàn)象最為顯著。7、PTPN_2基因敲除對角質(zhì)形成細(xì)胞增殖功能的影響應(yīng)用MTS方法,檢測PTPN_2基因敲除對角質(zhì)形成細(xì)胞增殖功能的影響。結(jié)果顯示,PTPN_2基因敲除可以顯著促進(jìn)細(xì)胞的增殖,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。(p0.05)8、沙利度胺對PTPN_2過表達(dá)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖功能的影響應(yīng)用MTS方法,檢測沙利度胺對PTPN_2過表達(dá)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖功能的影響。結(jié)果顯示,沙利度胺可以增加PTPN_2過表達(dá)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖能力,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。(p0.05)9、PTPN_2對OSMR相關(guān)通路蛋白表達(dá)的影響(1)沙利度胺對PTPN_2基因敲除角質(zhì)形成細(xì)胞Stat3和P-Stat3表達(dá)的影響。PTPN_2敲除角質(zhì)形成細(xì)胞P-Stat3表達(dá)量明顯增多,加入沙利度胺后,P-Stat3表達(dá)量減少。這與OSMR基因敲除對P-Stat3作用的影響正好相反,提示OSMR基因與PTPN_2可能位于同一條信號通路上,且OSMR基因位于PTPN_2上游,OSMR基因抑制PTPN_2的作用。PTPN_2基因敲除對Stat3的表達(dá)無明顯影響。(2)PTPN_2基因敲除對角質(zhì)形成細(xì)胞P-Stat5和Stat5表達(dá)量無影響,對Akt和P-Akt表達(dá)量無影響。(3)沙利度胺對PTPN_2基因過表達(dá)角質(zhì)形成細(xì)胞Stat3和P-Stat3表達(dá)的影響。PTPN_2過表達(dá)角質(zhì)形成細(xì)胞P-Stat3表達(dá)量減少,加入沙利度胺后,P-Stat3表達(dá)量增加。這與OSMR基因敲除對P-Stat3作用同向,再次驗證了OSMR基因與PTPN_2可能位于同一條信號通路上,且OSMR基因位于PTPN_2上游,OSMR基因抑制PTPN_2的作用。PTPN_2基因過表達(dá)對Stat3的表達(dá)無明顯影響。(4)PTPN_2過表達(dá)對角質(zhì)形成細(xì)胞P-Stat5和Stat5表達(dá)量無影響,對Akt和P-Akt表達(dá)無影響。10、Stat3通路抑制劑對PTPN_2和OSMR基因敲除細(xì)胞增殖功能的影響加入STA-21后,PTPN_2基因敲除和OSMR基因敲除角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖功能都受到顯著抑制。由此可見,PTPN_2基因和OSMR基因?qū)��?xì)胞增殖的影響通過Stat3通路起作用。STA-21可以顯著抑制,加入沙利度胺作用后的兩組基因敲除細(xì)胞角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖能力。由此可見,沙利度胺可能通過Stat3通路,對PTPN_2基因敲除和OSMR基因敲除角質(zhì)形成細(xì)胞增殖功能產(chǎn)生影響。結(jié)論:1、OSMR基因敲除降低角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖能力,增加凋亡水平。2、沙利度胺增加OSMR基因敲除角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖能力,降低凋亡水平,增加P-Stat3的表達(dá)水平。3、OSMR基因敲除上調(diào)角質(zhì)形成細(xì)胞TC-PTP表達(dá),作用于Stat3通路。4、沙利度胺可能作用于Stat3通路,通過對TC-PTP或其上游分子發(fā)生作用,對OSMR相關(guān)通路蛋白表達(dá)以及細(xì)胞的生物學(xué)功能產(chǎn)生影響。
【學(xué)位單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R758.3
【部分圖文】：

1 前言粉樣變（Primary cutaneous amyloidosis，PCA）型的組織病理學(xué)改變?yōu)楸砥ぜ��?xì)胞層增厚和角化物質(zhì)沉積[1]。淀粉樣物質(zhì)的形成與角質(zhì)形成細(xì)胞淀粉樣變病例為散發(fā)，但是南美洲和臺灣曾多次發(fā)性皮膚淀粉樣變（Familial PCA，F(xiàn)PCA）[3]�；�礎(chǔ)是通過基因連鎖分析和候選基因分析方法對臺灣的FPCA家系進(jìn)行了基因組掃描，發(fā)現(xiàn)了在連鎖[3]。隨后，通過對五號染色體存在連鎖的基因定位于OSMR基因（oncostatin M receptor (OR基因突變位點如下圖所示（圖1.1），其中P694

2圖1.2 OSMR基因突變導(dǎo)致信號通路傳導(dǎo)障礙OSM可以誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞遷移，引起表皮增生[7]。IL31是近年來發(fā)現(xiàn)的，與皮膚瘙癢密切相關(guān)[13]。在小鼠淋巴細(xì)胞中高表達(dá)IL31可以引起搔抓和

家族病例 3 10 8 3 2 2 2 2 2 1均值 8.08 6.58 5.17 4.50 4.17 2.60 2.60 2.00 1.60標(biāo)準(zhǔn)差 0.88 1.04 1.25 1.23 1.28 0.40 0.40 0.55 0.68沙利度胺劑量100mg/d 75mg/d 50mg/d注：應(yīng)用視覺模擬評分方法(VAS)評價瘙癢強度，0 分-10 分3.2 驗證 siRNA 轉(zhuǎn)染方法敲除 OSMR 基因效率1、分別于小干擾RNA轉(zhuǎn)染24、48、72小時提取細(xì)胞RNA，進(jìn)行基因敲除驗證。結(jié)果如下圖，圖中可見在RNA水平OSMR基因的敲除效率良好。圖3.1為O基因擴增曲線，圖3.2為RNA水平OSMR基因敲除效率。（* p<0.05，** p<0.01p<0.001，**** p<0.001，T檢驗）
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