發(fā)布時(shí)間：2020-04-19 04:20

【摘要】：第一部分:提取方不同法對(duì)小鼠海馬AD相關(guān)蛋白電泳的影響目的:探索不同提取方法對(duì)小鼠海馬AD(Alzheimer's Disease)相關(guān)蛋白電泳結(jié)果的影響,為更準(zhǔn)確地研究不同干預(yù)條件下AD小鼠模型中海馬AD相關(guān)蛋白表達(dá)量的變化提供研究基礎(chǔ)。方法:分別采用新鮮組織試劑盒提取法、新鮮組織超聲波破碎法、速凍組織試劑盒提取法和速凍組織研磨法提取C57BL/6小鼠海馬組織蛋白,然后利用SDS-PAGE電泳技術(shù)進(jìn)行蛋白分離,考馬斯亮藍(lán)染色觀察不同提取方法中蛋白條帶的分布和數(shù)量,并進(jìn)一步通過Western Blot分析不同提取方法對(duì)腦組織特異性蛋白免疫印跡結(jié)果的影響。結(jié)果:四種提取方法均能有效提取腦組織蛋白,其中新鮮組織超聲法提取的海馬組織蛋白總量最高�？捡R斯亮藍(lán)染色結(jié)果顯示:新鮮組織超聲法提取的海馬組織蛋白條帶最為清晰,條帶數(shù)量最多;但Western Blot分析結(jié)果顯示:Tau phosphoSerine 396通過新鮮組織試劑盒提取法獲得的蛋白條帶豐度最高,而Neurofilament-L通過新鮮組織超聲波破碎法和速凍組織試劑盒法所獲得的蛋白條帶豐度最高,其他AD相關(guān)蛋白采用速凍組織研磨法均可獲得較高豐度的特異性蛋白條帶。結(jié)論:不同蛋白提取方法對(duì)不同腦組織蛋白的提取效率存在明顯差異,速凍組織研磨法可高效提取大部分小鼠海馬AD相關(guān)蛋白。第二部分:2型糖尿病小鼠認(rèn)知功能評(píng)價(jià)及海馬AD相關(guān)蛋白和lnc RNAs的差異表達(dá)分析目的:2型糖尿病是認(rèn)知功能減退和癡呆的高危因素,但其病理機(jī)制尚不清楚。lnc RNA(long non-coding RNA)是一類長度超過200個(gè)核苷酸、不編碼蛋白質(zhì)的功能性RNA分子,近年來許多研究表明,lnc RNA與AD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究以lnc RNA為切入點(diǎn),利用基因芯片及生物信息學(xué)技術(shù),篩選2型糖尿病認(rèn)知功能障礙db/db小鼠海馬組織中差異表達(dá)的lnc RNA和m RNA,以期發(fā)現(xiàn)lnc RNA參與2型糖尿病認(rèn)知功能障礙發(fā)生發(fā)展的新機(jī)制。方法:通過小鼠Y迷宮與新事物識(shí)別實(shí)驗(yàn)分別評(píng)估db/m對(duì)照組鼠和2型糖尿病db/db鼠的空間工作記憶能力和短時(shí)記憶能力,然后分別提取兩組小鼠海馬組織的總蛋白和總RNA,并利用蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)和基因芯片技術(shù)分別對(duì)海馬AD相關(guān)蛋白以及l(fā)nc RNA和m RNA進(jìn)行差異表達(dá)分析,采用散點(diǎn)圖、聚類分析等方法,展示lnc RNA及m RNA差異基因的分布情況,通過GO分析和KEGG分析,對(duì)差異表達(dá)lnc RNA的鄰近差異表達(dá)m RNA的功能進(jìn)行聚類富集分析,預(yù)測(cè)差異表達(dá)lnc RNA可能涉及的生物過程及參與的信號(hào)通路。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)篩選的差異表達(dá)lnc RNA和m RNA進(jìn)行檢測(cè)和驗(yàn)證,并構(gòu)建差異表達(dá)的lnc RNA-m RNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果:行為學(xué)結(jié)果顯示,與db/m小鼠相比,db/db糖尿病小鼠的空間記憶力和短時(shí)記憶能力顯著下降(P0.01);Western Blot結(jié)果顯示,與db/m小鼠相比,db/db小鼠海馬組織中P-GSK3β蛋白表達(dá)顯著升高,磷酸化tau蛋白(p-tau Ser396)與總Tau蛋白(tau 46)比值以及α-Synuclein,P-GSK3α蛋白表達(dá)也有明顯增高趨勢(shì);基因芯片檢測(cè)結(jié)果顯示,兩組小鼠顯著性差異表達(dá)的lnc RNAs共有75個(gè),其中,相比正常db/m組,db/db組小鼠海馬組織上調(diào)的lnc RNAs有22個(gè),下調(diào)的lnc RNAs有53個(gè),芯片數(shù)據(jù)同時(shí)表明顯著性差異表達(dá)的m RNAs共有27個(gè),其中,db/db組小鼠海馬組織上調(diào)的m RNAs有17個(gè),下調(diào)的m RNAs有10個(gè);采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)芯片差異表達(dá)的基因進(jìn)一步驗(yàn)證,隨機(jī)挑選6個(gè)差異表達(dá)的lnc RNA和8個(gè)差異表達(dá)的m RNA進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證,RT-PCR結(jié)果與lnc RNA芯片檢測(cè)結(jié)論一致;對(duì)db/db鼠和db/m鼠海馬組織差異表達(dá)lnc RNAs做cis靶基因預(yù)測(cè),cis靶基因GO富集分析結(jié)果顯示lnc RNAs涉及下列生物學(xué)過程,蛋白質(zhì)定位調(diào)控、磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白激酶活化和MAPK級(jí)聯(lián),這些基因功能在學(xué)習(xí)記憶中及AD發(fā)展中發(fā)揮重要功能;cis靶基因KEGG通路分析結(jié)果顯示差異表達(dá)lnc RNAs相關(guān)的編碼基因涉及下列通路,VEGF信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、GABAergic synapse,這些通路在神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)控過程中發(fā)揮重要功能;lnc RNA-m RNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析包含了6個(gè)lnc RNAs和20個(gè)m RNAs,結(jié)果明確了lnc RNA與m RNA的相關(guān)性。結(jié)論:本研究展示了與2型糖尿病認(rèn)知功能損傷相關(guān)的海馬lnc RNA差異表達(dá)譜,并預(yù)測(cè)了差異表達(dá)的lnc RNA可能參與糖尿病認(rèn)知功能損傷發(fā)生發(fā)展的多條信號(hào)調(diào)控通路,本研究結(jié)論將為今后進(jìn)一步研究2型糖尿病認(rèn)知功能損傷的發(fā)病機(jī)制提供新的思路和線索。
【圖文】：

四種提取方法均能有效提出小鼠海馬腦組織總蛋白（圖1-1），其中蛋白產(chǎn)量最高的是新鮮組織超聲波破碎法（111.47±8.00）mg/g，，其次是新鮮組織試劑盒提取法（81.30±4.01）mg/g，速凍組織研磨法（63.84±3.30）mg/g，速凍組織試劑盒提取法蛋白提取產(chǎn)量最低（52.16±8.95）mg/g。圖 1-1 采用 4 種蛋白提取方法，組 1：新鮮組織試劑盒提取法；組 2：新鮮組織超聲波破碎法；組 3：速凍組織試劑盒提取法；組 4：速凍組織研磨法，分別提取海馬組織蛋白。aP＜0.05 vs 組 3 和組 4,bP＜0.01 vs 組 3 和組 4。Figure 1-1 Protein contents in mouse hippocampal tissue extracts as estimated by four protein extractionmethods. Group 1, 2, 3, 4 is commercial Kit method for fresh tissue, ultrasonic-assisted method for freshtissue, commercial Kit method for grinding quick-freezing tissues and liquid nitrogen grinding method,respectively.aP＜0.05 vs group 3 and 4,bP＜0.01 vs group 3 and 4.4.2 不同提取方法所獲得小鼠海馬腦組織總蛋白質(zhì)的 SDS-PAGE 電泳分析四種提取方法所獲得的蛋白經(jīng) SDS-PAGE 電泳和考馬斯亮藍(lán)染色，結(jié)果顯示 (圖 1-2)

所得蛋白經(jīng) SDS-PAGE 電泳和考馬斯亮藍(lán)染色，泳道 1,2,3法；組 2，新鮮組織超聲波破碎法；組 3，速凍組織試劑盒ie brilliant blue stained gel from the SDS-PAGE of proteins four protein extraction methods. Lanes 1, 2, 3 and 4 are Commercial Kit method for fresh tissue; Lane 2. Ultrasonic-asmercial Kit method for grinding quick-freezing tissues; La法對(duì)不同腦組織特異性蛋白提取效率的 Wes同蛋白提取方法對(duì)小鼠海馬腦組織特異性蛋別利用針對(duì)不同AD相關(guān)蛋白的抗體進(jìn)行W
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R587.2

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本文編號(hào)：2632921