【摘要】：目的:研究葛根素對MC3T3-E1成骨細(xì)胞發(fā)育的影響及機(jī)制,為臨床治療骨質(zhì)疏松癥及葛根素的開發(fā)利用提供一定的理論指導(dǎo)。方法:1.細(xì)胞活性測定:不同濃度的(0.1,1,l0μM)葛根素培養(yǎng)成骨細(xì)胞24,48和72h后,CCK-8法檢測空白對照組和葛根素組的細(xì)胞活性。2.細(xì)胞分化水平測定:lμM葛根素作用于成骨細(xì)胞72h后測定細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)活性。3.細(xì)胞礦化水平測定:lμM葛根素處理成骨細(xì)胞7、14和21d后,茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色法測定細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)面積。4.蛋白表達(dá)水平測定:1μM葛根素作用細(xì)胞0,48,72h后以及100μM RAP(自噬激動(dòng)劑)和75μM 3-MA(自噬抑制劑)作用細(xì)胞72h后,Western Blotting法測定Beclin1和LC3B蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。5.細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察:1μM葛根素和100μM 3-MA作用成骨細(xì)胞72h后電鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)并拍攝圖片。6.自噬對成骨細(xì)胞的影響:使用100μM 3-MA作用MC3T3-E1細(xì)胞后,檢測成骨細(xì)胞增殖、分化和礦化能力的改變。7.葛根素對miR-204表達(dá)水平的影響:RT-qPCR法檢測葛根素作用后miR-204表達(dá)水平。8.miR-204的作用靶點(diǎn)預(yù)測:采用TargetScan靶點(diǎn)預(yù)測軟件分析miR-204與小鼠LC3B基因可能的結(jié)合位點(diǎn)。9.miR-204對成骨細(xì)胞自噬水平和超微結(jié)構(gòu)的影響:成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-204-siRNA后,檢測LC3B蛋白質(zhì)的表達(dá)水平并于電鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果:1.葛根素(0.1,1,10μM)可顯著促進(jìn)小鼠MC3T3-E1成骨細(xì)胞的增殖,1μμM葛根素為最佳濃度。與空白對照組相比,1μM的葛根素作用72h可明顯提高ALP活性,并促進(jìn)礦化結(jié)節(jié)的形成。2.1μM濃度葛根素作用于細(xì)胞后,與空白對照組比較自噬標(biāo)志物Be clinl和LC3B的蛋白質(zhì)表達(dá)水平明顯升高,其中72h作用效果最好,且作用72h后葛根素組LC3B的蛋白表達(dá)水平略高于自噬激動(dòng)劑組。此外,葛根素組細(xì)胞電鏡下可明顯觀察到自噬特有的雙層膜結(jié)構(gòu)。3.自噬抑制劑(3-MA)作用細(xì)胞72h后,明顯抑制成骨細(xì)胞增殖和分化,而對礦化結(jié)節(jié)形成影響不顯著。4.1μM葛根素作用細(xì)胞72h后,miR-204表達(dá)水平顯著下調(diào)。5.生物信息學(xué)分析表明,LC3B mRNA中的miR-204結(jié)合位點(diǎn)是位于LC3B 3'UTR的44和50bp之間的廣泛保守的元件。6.轉(zhuǎn)染miR-204-siRNA作用細(xì)胞后,與空白對照組比較,LC3B的蛋白質(zhì)表達(dá)水平明顯上升,并且電鏡下細(xì)胞出現(xiàn)自噬特有的雙層膜結(jié)構(gòu)。結(jié)論:(1)葛根素可以促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化和礦化。(2)葛根素作用于成骨細(xì)胞可以產(chǎn)生自噬現(xiàn)象。(3)葛根素作用成骨細(xì)胞產(chǎn)生的自噬可以促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化,對礦化影響不明顯。(4)下調(diào)miR-204表達(dá)導(dǎo)致LC3B表達(dá)增強(qiáng)可能是葛根素促成骨細(xì)胞自噬的分子機(jī)制。
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實(shí)驗(yàn)研究逡逑結(jié)果逡逑對ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細(xì)胞增殖能力的影響逡逑１可見，不同濃度的葛根素（０．１，邋１，邋ｌＯ＾Ｍ）分別處理ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細(xì)胞－８檢測結(jié)果顯示，與空白對照組相比，（除０．１和ｌＯ＾Ｍ葛根素作用２４根素作用細(xì)胞后，ＯＤ值均顯著增高。而ｌｐＭ葛根素作用７２ｈ促增殖ＡＬＰ堿性磷酸酶活性的檢測實(shí)驗(yàn)中將葛根素藥物濃度確定為ｌｕＭ，

３．葛根素對ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細(xì)胞形成礦化結(jié)節(jié)能力的影響逡逑通過茜素紅染色法計(jì)算礦化結(jié)節(jié)面枳，進(jìn)一步檢測葛根素對Ｎ１Ｃ３Ｔ３－Ｅ１細(xì)胞礦化的影逡逑響。如圖３Ａ－Ｂ所示，與對照組相比，用�。蜐舛雀鸶胤謩e處理細(xì)胞７，邋１４和２１ｄ／Ｔｆ，逡逑礦化結(jié)節(jié)的形成顯著增加。結(jié)果表明，葛根素能提高ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細(xì)胞的礦化能力，，促進(jìn)Ｍ逡逑Ｃ３Ｔ３－Ｅ１細(xì)胞的進(jìn)？？步分化成熟。逡逑灥v醻枺停歟殄澹輳輳剩潁椋潁戾義希悖錚睿簦潁錚戾澹ǎ保埃埃╁澹穡酰邋澹ǎ

本文編號：2629113