發(fā)布時間：2020-04-13 22:09

【摘要】：1前言百草枯(Paraquat,PQ),化學(xué)名稱1,1'-二甲基-4,4'-聯(lián)吡啶陽離子鹽,是一種非選擇性、接觸性的除草劑。在最近幾年,服用PQ自殺或意外中毒的發(fā)生率在一些亞洲國家特別是中國呈現(xiàn)增加的趨勢。雖然目前關(guān)于PQ中毒的體內(nèi)或體外相關(guān)研究有很多,但是對于PQ誘導(dǎo)肺損傷發(fā)病的分子機制還不完全清楚。因此,研究PQ誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞損傷的分子機制可以為將來更好的治療PQ中毒提供有用的理論基礎(chǔ)和新的治療靶點。PQ無論是在體內(nèi)實驗或體外實驗中均表現(xiàn)出誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的性質(zhì)。凋亡所起的作用是通過消除損傷或異常的細(xì)胞,進(jìn)而來維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。但在很多疾病的發(fā)展進(jìn)程中有異常凋亡的參與。肺泡上皮細(xì)胞在PQ中毒早期階段的凋亡增加是其后發(fā)生肺損傷和肺間質(zhì)纖維化的關(guān)鍵性事件。PQ通過損傷葉綠體干擾光合作用來對綠色植物發(fā)揮毒性作用。PQ通過損傷線粒體來實現(xiàn)對哺乳動物細(xì)胞的毒性作用。細(xì)胞凋亡的發(fā)生可直接由線粒體功能障礙所觸發(fā)。與此同時被稱為線粒體自噬的過程即通過溶酶體對損傷的線粒體進(jìn)行降解的過程也可以對損傷的線粒體進(jìn)行清除。對受損線粒體的及時清除有助于細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的恢復(fù),避免進(jìn)一步的細(xì)胞壞死或凋亡。P53在內(nèi)源性凋亡途徑介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起重要的作用。當(dāng)細(xì)胞受到外界凋亡刺激時,P53的表達(dá)增加,P53可通過轉(zhuǎn)錄依賴途徑調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達(dá),也可直接作用于線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。最近也有研究報道P53通過與線粒體自噬通路蛋白Parkin的相互作用抑制Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬來干擾損傷線粒體的清除。在本研究中選用人肺上皮樣細(xì)胞A549作為研究PQ誘導(dǎo)肺損傷的體外模型,觀察其凋亡過程是否涉及線粒體凋亡途徑與線粒體自噬途徑。進(jìn)一步探討PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬是否起保護(hù)作用以及P53抑制劑pifithrin-α(PFT-α)是否能通過減弱線粒體凋亡信號通路的活性與促進(jìn)PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬通路,來改善線粒體功能障礙,減少細(xì)胞凋亡。2材料與方法2.1實驗材料細(xì)胞株:人肺上皮樣細(xì)胞A549。2.2實驗分組2.2.1 PQ誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡模型建立與線粒體凋亡途徑相關(guān)指標(biāo)的檢測實驗分組:對照組(等量PBS)、PQ50μM組、PQ100μM組、PQ150μM組、PQ200μM組。各組細(xì)胞處理24h、48h后,檢測相關(guān)指標(biāo)。2.2.2 PFT-α通過線粒體凋亡途徑減弱PQ誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡實驗分組:對照組(0.1%DMSO)、PFT-α(30μM)預(yù)處理組、PQ(200μM)組、PFT-α(30μM)+PQ(200μM)組。各組細(xì)胞孵育24h后檢測相關(guān)指標(biāo)。2.2.3 PQ誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡過程中線粒體自噬途徑相關(guān)指標(biāo)的檢測實驗分組:對照組(加入等量PBS)、PQ50μM組、PQ100μM組、PQ150μM組、PQ200μM組。各組細(xì)胞培養(yǎng)24h后檢測相關(guān)指標(biāo)。2.2.4 PINK1/Parkin通路在PQ誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡中的作用實驗分組為:對照組(等量PBS)、si RNA組(Parkin siRNA轉(zhuǎn)染)、PQ(200μM)組、PQ(200μM)+siRNA(Parkin siRNA轉(zhuǎn)染)組。各組細(xì)胞培養(yǎng)24h后檢測相關(guān)指標(biāo)。2.2.5 PFT-α通過線粒體自噬途徑減弱PQ誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡實驗分組:對照組(0.1%DMSO)、PFT-α(30μM)預(yù)處理組、PQ(200μM)組、PFT-α(30μM)+PQ(200μM)組。各組細(xì)胞孵育24h后檢測相關(guān)指標(biāo)。2.3主要研究方法2.3.1 PQ誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡模型建立與線粒體凋亡途徑相關(guān)指標(biāo)的檢測(1)A549細(xì)胞培養(yǎng)并選用不同濃度的PQ處理。(2)MTT法檢測細(xì)胞活性。(3)Hoechst 33258染色,熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核的形態(tài);凋亡檢測試劑盒檢測細(xì)胞凋亡率。(4)Rh123染色后,熒光顯微鏡觀察線粒體膜電位;以及使用流式細(xì)胞儀檢測熒光強度。(5)使用Caspases活性檢測試劑盒檢測Caspase-3/-9活性。(6)Western blot檢測Bax、Bak、Bcl-2、Bcl-XL、β-actin蛋白表達(dá)量的變化。2.3.2 PFT-α通過線粒體凋亡途徑減弱PQ誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡(1)Western blot檢測P53蛋白表達(dá)量的變化。(2)使用PFT-α預(yù)處理,檢測凋亡率、線粒體膜電位、Caspase-3/-9活性。(3)使用PFT-α預(yù)處理,Western blot檢測Bax、Bcl-2、β-actin蛋白表達(dá)量的變化。2.3.3 PQ誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡過程中線粒體自噬途徑相關(guān)指標(biāo)的檢測(1)Mito Tracker Green(MTG)與Lyso Tracker Red(LTR)染色,熒光顯微鏡觀察線粒體自噬。(2)Western blot檢測PINK1、Parkin、P62、LC3B、COXIV、β-actin蛋白表達(dá)量的變化。2.3.4 PINK1/Parkin通路在PQ誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡中的作用通過轉(zhuǎn)染siRNA沉默Parkin基因,Western blot檢測Parkin蛋白的表達(dá)情況;進(jìn)一步檢測在沉默Parkin基因后,PQ對細(xì)胞凋亡率與Caspase-3/-9活性的影響。2.3.5 PFT-α通過線粒體自噬途徑減弱PQ誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡使用PFT-α預(yù)處理,Western blot檢測PINK1、Parkin、P62、LC3B、COXIV、β-actin蛋白表達(dá)量的變化。3結(jié)果3.1 PQ誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡模型建立與線粒體凋亡途徑相關(guān)指標(biāo)的檢測(1)PQ對A549細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒性,細(xì)胞活性和PQ作用時間和濃度呈依賴性方式降低。(2)Hoechst 33258染色發(fā)現(xiàn)PQ引起細(xì)胞核的固縮與裂解;細(xì)胞的凋亡率和PQ作用時間和濃度呈依賴性方式升高。(3)通過熒光顯微鏡與流式細(xì)胞儀觀察線粒體膜電位的變化,結(jié)果均顯示細(xì)胞的線粒體膜電位和PQ作用時間和濃度呈依賴性方式降低。(4)A549細(xì)胞Caspase-3與Caspase-9活性和PQ作用時間和濃度呈依賴性方式增加。(5)Western blot檢測顯示PQ處理后Bax、Bak的表達(dá)顯著增加;Bcl-2、Bcl-XL的表達(dá)顯著降低。3.2 PFT-α通過線粒體凋亡途徑減弱PQ誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡(1)Western blot檢測顯示PQ處理后P53的表達(dá)顯著增加。(2)PFT-α預(yù)處理顯著降低PQ引起的細(xì)胞凋亡率與線粒體膜電位的破壞并且抑制了Caspase-3與Caspase-9活性。(3)PFT-α預(yù)處理顯著降低Bax/Bcl-2相對蛋白水平比例。3.3 PQ誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡過程中線粒體自噬途徑相關(guān)指標(biāo)的檢測(1)使用MTG和LTR在A549細(xì)胞中共染色,然后通過熒光顯微鏡分析顯示PQ處理后線粒體自噬明顯增強。(2)Western blot檢測顯示PQ處理后PINK1、Total Parkin、Mito Parkin、LC3-II/LC3-I的表達(dá)顯著增加;P62的表達(dá)顯著降低。3.4 PINK1/Parkin通路在PQ誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡中的作用沉默Parkin基因后,總Parkin蛋白的表達(dá)受抑制;通過Parkin特異性siRNA預(yù)處理細(xì)胞再接受PQ處理與單獨PQ處理相比,前者具有更高的細(xì)胞凋亡率并且Caspase-3與Caspase-9活性顯著增加。3.5 PFT-α通過線粒體自噬途徑減弱PQ誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡PFT-α預(yù)處理再接受PQ處理A549細(xì)胞,線粒體自噬相關(guān)蛋白Mito Parkin與LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)增加。4結(jié)論(1)PQ通過激活線粒體凋亡通路誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡。(2)PQ誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡中同時也激活線粒體自噬。(3)PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬在PQ誘導(dǎo)的A549細(xì)胞損傷中起到直接的保護(hù)作用。(4)P53抑制劑PFT-α通過線粒體凋亡途徑與PINK1/Parkin途徑減弱PQ誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡。
【圖文】：

圖 1 MTT 檢測不同分組細(xì)胞活性的改變用 PQ（50，100，150 和 200μM）或 PBS 處理 A549 細(xì)胞 24h 或 48h 后，通過 檢測細(xì)胞活性。數(shù)據(jù)以 x±s 表示，獨立重復(fù) 3 次：**P <0.01，同一時間點不同濃度與對照組比較；##P<0.01 相同濃度 PQ 組在 48h 與 24h 相比。3.1.2 細(xì)胞核形態(tài)的改變當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時，細(xì)胞核會出現(xiàn)固縮或碎裂等凋亡特征的改變。H33258 染色后，通過熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核的形態(tài)，可以將正常細(xì)胞與凋區(qū)分出來。在本實驗中為了檢查 PQ 處理的 A549 細(xì)胞是否伴有形態(tài)學(xué)變用 Hoechst 33258 染色 PQ 處理的 A549 細(xì)胞并通過熒光顯微鏡觀察細(xì)胞態(tài)。 在 PQ 處理后觀察到 A549 細(xì)胞的出現(xiàn)一些凋亡的特征性改變，可清現(xiàn)核固縮和核碎裂（見圖 2）。

圖 4 PQ 導(dǎo)致的 A549 細(xì)胞線粒體膜電位的改變用 PQ（50，100，150 和 200μM）或 PBS 處理 A549 細(xì)胞 24h 或 48h。Rh 123 染通過熒光顯微鏡觀察與流式細(xì)胞術(shù)檢測熒光強度來評價線粒體膜電位。圖 A：使用熒光鏡觀察 PQ 對 A549 細(xì)胞線粒體膜電位的影響（×400）。圖 B：Rh 123 染色后流式細(xì)胞測 A549 細(xì)胞線粒體膜電位的變化。圖 C：流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果的統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以 示，獨立重復(fù) 3 次：**P <0.01，同一時間點不同濃度 PQ 組與對照組比較；##P<0.0濃度 PQ 組在 48h 與 24h 相比。3.1.5 Caspases 檢測試劑盒測定 Caspase-3/-9 活性在細(xì)胞凋亡的執(zhí)行階段，，Caspases 家族在其中扮演著非常重要的角色。體跨膜電勢的降低可使細(xì)胞色素 C 從線粒體中釋放至細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，從而激酶原形式存在的 Caspase-9。激活的 Caspase-9 可進(jìn)一步使下游的 Caspase-3 執(zhí)行細(xì)胞的凋亡。本實驗為了進(jìn)一步研究 PQ 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，用不同濃度
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R595.4

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 李國強;李國鋒;李玉明;;百草枯中毒的毒代動力學(xué)研究進(jìn)展[J];中華勞動衛(wèi)生職業(yè)病雜志;2014年06期

2 黃英;肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡在急性肺損傷中的作用[J];中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志;2002年03期

本文編號：2626501